Поређење различитих техника за микроскопију супер резолуције
За конвенционалну светлосну микроскопију, дифракција светлости ограничава резолуцију слике на приближно 250 нм. Данас технике супер-резолуције то могу побољшати за више од фактора 10. Ова техника се углавном постиже кроз три методе: микроскопија за локализацију једног молекула, укључујући фотосензитивну локализаторску микроскопију (ПАЛМ) и микроскопију стохастичке оптичке реконструкције (СТОРМ); структурисана илуминациона микроскопија (СИМ); и микроскопија стимулисаног исцрпљивања емисија (СТЕД). Како одабрати технологију супер резолуције је оно до чега је свима стало. „Нажалост, не постоје једноставни принципи за одлучивање који метод користити“, каже Метју Стрејси, постдокторски истраживач на Универзитету Оксфорд, Велика Британија. „Свако има своје предности и мане. Научници, наравно, такође смишљају како да одаберу прави метод за одређени пројекат. "У контексту биоимагинга, кључни фактори које треба узети у обзир укључују: просторну и временску резолуцију, осетљивост на фотооштећење, капацитет обележавања, дебљину узорка и позадинску флуоресценцију или аутологну флуоресценцију ћелије." Како функционише Различити микроскопи супер-резолуције раде на различите начине. У случају ПАЛМА и ОЛУЈЕ, само мали део флуоресцентних маркера се побуђује или фотоактивира у датом тренутку, што омогућава њихову независну локализацију са великом прецизношћу. Пролазак кроз овај процес са свим флуоресцентним етикетама резултира комплетном сликом супер резолуције. Стефан Хел, један од добитника Нобелове награде за хемију 2014. и директор Института за биофизичку хемију Макс Планк, рекао је: „Систем ПАЛМ/СТОРМ је релативно једноставан за постављање, али га је тешко применити, јер флуоресцентно група мора да има способност фотоактивације. Ограничења Недостатак је што треба да детектују један флуоресцентни молекул у контексту ћелије и мање су поуздани од СТЕД." СТЕД користи ласерски импулс да побуђује флуорофор и ласер у облику прстена да угаси флуорофор, остављајући само флуоросценцију средње величине нанометара за супер-резолуцију. Скенирањем целог узорка добија се слика. „Предност СТЕД-а је у томе што је то технологија са дугметом“, објаснио је Хелл. "Ради као стандардни конфокални флуоресцентни микроскоп." Такође може да слика живе ћелије користећи флуорофоре као што су зелени или жути флуоресцентни протеини и боје добијене од родамина. Параметарско поређење Иако све технике супер-резолуције превазилазе конвенционалну светлосну микроскопију у смислу резолуције, оне се међусобно разликују. СИМ отприлике удвостручује резолуцију на око 100 нм. ПАЛМ и СТОРМ могу да разреше циљеве од 15 нм. Према Хелл-у, СТЕД обезбеђује просторну резолуцију од 30 нм у живим ћелијама и 15 нм у фиксним ћелијама. Када су у питању специфичне апликације, морамо узети у обзир и однос сигнал-шум. У неким случајевима, нижа резолуција али већи СНР може резултирати бољом сликом од супротног (већа резолуција, али нижи СНР). Брзина добијања слике је такође веома важна, посебно за живе ћелије. "Све технике супер-резолуције су спорије од конвенционалних техника флуоресцентног снимања", рекао је Страци. „ПАЛМ/СТОРМ је најспорији, потребно му је десетине хиљада кадрова да би се добила једна слика, СИМ-у су потребне десетине кадрова, а СТЕД је технологија скенирања, тако да брзина аквизиције зависи од величине видног поља.“ Поред живих ћелија или фиксних ћелија за снимање, неки научници такође желе да разумеју како се објекти крећу. Страци је заинтересован за разумевање динамике биолошких система у живим ћелијама, а не само за статичне слике. Он комбинује ПАЛМ са праћењем једне честице да би анализирао динамику у живим ћелијама. На овај начин он може директно пратити молекуле маркера док обављају своје функције. Међутим, он верује да СИМ није погодан за проучавање ових динамичких процеса на молекуларном нивоу, али је због своје велике брзине аквизиције посебно погодан за посматрање динамике већих структура, као што су цели хромозоми. Најновији резултати У 2017. години, Хелл-ов тим је у Науци пријавио микроскоп супер резолуције МИНФЛУКС. Према Хелл-у, ова метода супер-резолуције по први пут постиже просторну резолуцију од 1 нм. Поред тога, може пратити појединачне молекуле у живим ћелијама најмање 100 пута брже од других метода. Други научници су такође похвално говорили о микроскопу МИНФЛУКС. „Нове апликације и приступи се стално развијају, али ми се истичу два напретка“, рекао је Шехтман. Један је МИНФЛУКС. „Користи генијалан приступ да би добио веома прецизно молекуларно позиционирање. Што се тиче другог узбудљивог развоја догађаја, Шехтман је поменуо ВЕ Моернера и његове колеге са Универзитета Станфорд. Моернер је такође добио Нобелову награду за хемију 2014. Један од победника. Да би се позабавили ограничењем резолуције слике узрокованом анизотропним расипањем флуоресцентних појединачних молекула, научници су користили различите поларизације побуде да би одредили оријентацију и положај молекула. Поред тога, развили су деликатне површине зеница. Ове технике побољшавају способност локализације структура. О флуоресцентним етикетама У многим апликацијама са супер резолуцијом, етикете су заиста важне. Постоје и неке компаније које пружају сродне производе. На пример, немачки Милтении се удружио са Аббериор, компанијом коју је основао Стефан Хелл, како би обезбедио прилагођене услуге коњугације антитела за микроскопске боје супер резолуције. Бројне друге компаније такође нуде одговарајуће маркере. „Наши нано-појачивачи су веома мали, само 1,5 кДа и веома специфични,“ каже Цхристопх Ецкерт, службеник за маркетинг у ЦхромоТек-у. Ови протеини везују зелене и црвене флуоресцентне протеине (ГФП и РФП). Они су изведени из фрагмената антитела алпаке, познатих као ВХХ или нанотела, са одличним својствима везивања и стабилним квалитетом без варијација од серије до серије. Ови маркери су погодни за различите технике супер-резолуције, укључујући СИМ, ПАЛМ, СТОРМ и СТЕД. Аи-Хуи Танг, доцент на Медицинском факултету Универзитета Мериленд, и његове колеге користили су ЦхромоТек-ов ГФП-Боостер и СТОРМ да би истражили ширење информација у нервном систему. Пронашли су молекуларне нанокластере, зване наноколоне, у пресинаптичким и постсинаптичким неуронима. Научници верују да ова структура показује да централни нервни систем користи једноставне принципе за одржавање и регулисање синаптичке ефикасности. Различите верзије снимања у супер резолуцији и све већи број метода одводе научнике још дубље у биолошке мистерије. Пробијањем границе дифракције видљиве светлости, биолози могу чак и да „помно прате” деловање ћелија.
