Тренд развоја конфокалне микроскопије
Да би се добили бољи резултати посматрања на техничком нивоу, конфокална микроскопија се фокусира на побољшање техничког нивоа са аспеката побољшања резолуције, смањења фототоксичности, повећања брзине скенирања, посматрања дебелих узорака и посматрања ин виво. Тренутно је З ефикасан. Оно што промовише Зда за технологију конфокалне микроскопије је микроскопија ултра високе резолуције, која пробија оптичку границу и омогућава истраживачима да добију финије ћелијске структуре, што је погодно за дубље разумевање животних активности истраживача. Следећи фокус истраживања технологије конфокалне микроскопије требало би да се фокусира на следеће тачке:
1. Већа брзина скенирања
Тренутно је брзина конфокалног скенирања ограничена механичком структуром опреме за скенирање, а резолуција се може жртвовати само да би се постигла већа брзина скенирања. Многи биолошки процеси су толико брзи да се не могу открити.
2. Савршенија технологија ултра високе резолуције
Тренутно, технологије ултра високе резолуције укључују СТОРМ, ПАЛМ, СТЕД и ССИМ, са резолуцијама у распону од 20 до 200 нм, али свака технологија има одређене недостатке, као што су обрада узорка, правац З-осе, фототоксичност, итд. није ни приближно савршено, и често је тешко постићи граничну резолуцију у стварном посматрању.
3. Јача компатибилност
Технологија конфокалне микроскопије укључује различите методе ексцитације, као што је горе поменуто посматрање вишефотона и светлосног слоја, а кохерентно анти-Стоксово Раманово расејање теоретски може делити скуп ласерских система. Микроскоп супер резолуције може бити упарен са технологијом белог ласера. Међутим, због проблема са патентима различитих компанија, још увек постоји простор за побољшање у погледу комплетности и компатибилности, а тренутна опрема не може у потпуности да искористи техничке предности апликације.
Принципи конфокалне микроскопије
Конфокални микроскоп се састоји од четири дела: оптичког система микроскопа, ласерског извора светлости, скенера и система за детекцију и обраду. Као извор светлости користи ласер са добром кохерентношћу. Усваја коњуговани принцип фокусирања и уређај на основу традиционалног оптичког микроскопа, и користи компјутерски сет система за посматрање, анализу и излаз за обраду слике.
Ласерски сноп за скенирање пролази кроз отвор на решетки и формира тачкасти извор светлости, који се рефлектује на сочиво објектива кроз разделник снопа, фокусира се на узорак и скенира. Након што се узорак побуђује, емитована флуоресценција се враћа у спектроскоп и скупља је до отвора за детекцију, а затим се претвара у електрични сигнал помоћу фотомултипликатора и преноси на рачунар да прикаже јасну слику у фокалној равни. Побуђена светлост је фокусирана на узорак кроз отвор на решетки, а флуоресценција је фокусирана на отвор кроз сочива објектива. Овај процес формира два фокуса, па се назива конфокални микроскоп.
Обични биолошки узорци имају сложену структуру и одређену дебљину. Када се посматра са обичним флуоресцентним микроскопом, флуоресценција коју емитује узорак се преклапа једна са другом, а резолуција слике је знатно смањена.
Конфокална слика конфокалног микроскопа може ефикасно потиснути залуталу светлост и светлост која није мерна ван фокалне равни да уђе у детектор, оствари слику у једној фокалној равни и у великој мери побољша резолуцију. Када се бина равномерно креће у хоризонталном правцу, може да формира јасну једнослојну слику, ау вертикалном смеру може да реализује слој по слој скенирање узорка на различитим дубинама и добије тродимензионалну структуру узорка након тродимензионалне реконструкције, а то је такозвани „оптички ЦТ“. Узорак се обележава флуоресцентном сондом, а затим се посматра конфокалним микроскопом. Не само да се могу посматрати различите фиксне ћелије и структуре ткива, већ се морфологија, структура и јони живих ћелија могу квалитативно и квантитативно посматрати и редовно мерити.
