Разлика између флуоресцентног микроскопа и нормалног микроскопа
1. Погледајте начин осветљења
Метода осветљења флуоресцентног микроскопа је генерално епи-тип, то јест, извор светлости се поставља на испитни узорак кроз сочиво објектива.
2. Погледајте резолуцију
Флуоресцентни микроскопи користе ултраљубичасто светло као извор светлости, са релативно кратком таласном дужином, али је резолуција већа од оне код обичних оптичких микроскопа.
3, разлика у филтеру
Флуоресценцијски микроскоп користи два специјална филтера, који се користе испред извора светлости за филтрирање видљиве светлости, а користе се између сочива објектива и окулара за филтрирање ултраљубичастог светла, које може заштитити људске очи.
Флуоресцентни микроскоп је такође врста оптичког микроскопа, углавном зато што је таласна дужина коју побуђује флуоресцентни микроскоп кратка, па то доводи до разлике у структури и употреби флуоресцентног микроскопа и обичног микроскопа. Већина флуоресцентних микроскопа има добру функцију хватања слабе светлости. , тако да је под изузетно слабом флуоресценцијом његова способност снимања такође добра. Заједно са сталним побољшањем флуоресцентне микроскопије последњих година, бука је такође значајно смањена. Због тога се све више користе флуоресцентни микроскопи.
Познавање двофотонске флуоресцентне микроскопије
Основни принцип двофотонске ексцитације је: у случају велике густине фотона, флуоресцентни молекули могу истовремено да апсорбују два фотона дугих таласа, а након веома кратког века трајања такозваног побуђеног стања, емитују фотон кратке таласне дужине. ; ефекат је исти као коришћење фотона са таласном дужином упола мањом од дуге таласне дужине за побуђивање флуоресцентног молекула. Двофотонско побуђивање захтева велику густину фотона, а како не би оштетили ћелије, двофотонска микроскопија користи импулсне ласере са закључавањем мода високе енергије. Овај ласер емитује ласерску светлост са високом вршном енергијом и ниском просечном енергијом, са ширином импулса од само 100 фемтосекунди и фреквенцијом од 80 до 100 МХз. Када се објектив објектива са високим нумеричким отвором користи за фокусирање фотона пулсирајућег ласера, густина фотона у фокусној тачки сочива објектива је највећа, а двофотонско побуђивање се јавља само у фокусној тачки објективног сочива, тако да двофотонском микроскопу није потребна конфокална рупица, што побољшава ефикасност детекције флуоресценције.
У општем феномену флуоресценције, због ниске густине фотона ексцитационе светлости, флуоресцентни молекул може да апсорбује само један фотон у исто време, а затим да емитује флуоресцентни фотон кроз транзицију зрачења, која се назива једнофотонска флуоресценција. За процес побуђивања флуоресценције са ласером као извором светлости, може доћи до појаве двофотонске или чак вишефотонске флуоресценције. У овом тренутку, интензитет ексцитационог извора светлости који се користи је висок, а густина фотона испуњава захтев да флуоресцентни молекул истовремено апсорбује два фотона. У процесу коришћења општег ласера као извора побудне светлости, густина фотона још увек није довољна да произведе двофотонску апсорпцију. Обично се користи фемтосекундни пулсни ласер, а његова тренутна снага може достићи редослед мегавата. Према томе, таласна дужина двофотонске флуоресценције је краћа од таласне дужине ексцитационе светлости, што је еквивалентно ефекту који производи побуђивање таласном дужином полупобуђења.
Двофотонска флуоресцентна микроскопија има многе предности:
1) Светлост дугих таласа је мање погођена расејањем од светлости кратког таласа и може лако продрети у узорак;
2) Флуоресцентни молекули изван фокалне равни нису побуђени, тако да више ексцитационе светлости може доћи до фокалне равни, тако да побудна светлост може продрети у дубље узорке;
3) Блиско инфрацрвено светло дугих таласа је мање токсично за ћелије од светлости кратких таласа;
4) Када се узорци посматрају двофотонском микроскопијом, фотобељење и фототоксичност су присутни само у фокалној равни. Због тога је двофотонска микроскопија погоднија за посматрање дебелих узорака него једнофотонска микроскопија, за посматрање живих ћелија или за извођење експеримената фотобељења са фиксном тачком.
Познавање конфокалне флуоресцентне микроскопије
Основни принцип конфокалне флуоресцентне микроскопије: коришћењем тачкастог извора светлости за осветљавање узорка, на фокалној равни се формира мала светлосна тачка са добро дефинисаним обрисом. који се састоји од разделника снопа. Разделник снопа шаље флуоресценцију директно на детектор. Испред извора светлости и детектора налази се рупица, односно рупица за осветљење и рупица за детекцију. Геометријске димензије ова два су исте, око 100-200 нм; у односу на светлосну тачку на фокалној равни, ова два су коњугирана, то јест, светлосна тачка пролази кроз низ сочива и коначно може бити фокусирана на отвор за осветљење и отвор за детекцију у исто време. На овај начин, светлост из фокалне равни се може концентрисати у домету отвора за детекцију, док је расејана светлост изнад или испод фокалне равни блокирана ван отвора за детекцију и не може се снимити. Узорак се скенира тачку по тачку ласером, а фотомултипликаторска цев након детекције рупице такође добија конфокалну слику одговарајуће светлосне тачке тачку по тачку, која се конвертује у дигитални сигнал и преноси на рачунар, и коначно агрегира на екран у јасну конфокалну слику целе фокалне равни. .
Свака слика у фокалној равни је заправо оптички попречни пресек узорка, а овај оптички пресек увек има одређену дебљину, познату и као оптички пресек. Пошто је интензитет светлости у жижној тачки много већи од оног у нефокалној тачки, а светлост у нефокалној равни филтрира рупица, дубина поља конфокалног система је приближно нула, а скенирање дуж З-оса може да реализује оптичку томографију, формирајући Посматрајте дводимензионални оптички пресек на фокусираној тачки узорка. Комбиновањем скенирања у равни КСИ (фокална раван) са скенирањем по З-оси (оптичка оса), акумулацијом дводимензионалних слика сукцесивних слојева и обрадом помоћу специјалног компјутерског софтвера, може се добити тродимензионална слика узорка.
То јест, рупица за детекцију и рупица извора светлости су увек фокусирани на исту тачку, тако да флуоресценција побуђена изван равни фокусирања не може ући у рупицу за детекцију.
Једноставан израз принципа рада конфокалног ласера је да користи ласер као извор светлости, а на основу традиционалног флуоресцентног микроскопа, прикачени су уређај за ласерско скенирање и коњуговани уређај за фокусирање, а дигитална аквизиција и обрада слике систем контролише рачунар.
