Разлика између обичног микроскопа и флуоресцентног микроскопа
Флуоресцентни микроскопи користе ултраљубичасто светло као извор светлости за зрачење објекта који треба да се прегледа, тако да објекат емитује светлост, а затим посматра објекат под микроскопом. Углавном се користи за ћелије имунофлуоресценције. Углавном се састоји од извора светлости, система филтерских плоча и оптичког система за посматрање флуоресцентне слике узорка кроз увећање окулара и сочива објектива. Хајде да погледамо разлику између овог флуоресцентног микроскопа и обичног оптичког микроскопа.
1. У погледу метода осветљења
Метода осветљења флуоресцентног микроскопа је генерално епископска, то јест, извор светлости се пројектује на испитни узорак кроз сочиво објектива.
2. У погледу резолуције
Флуоресцентни микроскопи користе ултраљубичасто светло као извор светлости. Таласна дужина је релативно кратка, али је резолуција већа од оне код обичних оптичких микроскопа.
3. Разлика у филтеру
Флуоресцентни микроскоп користи два специјална филтера, који се користе испред извора светлости за филтрирање видљиве светлости, а користе се између сочива објектива и окулара за филтрирање ултраљубичастог светла, које може заштитити људске очи.
Флуоресцентни микроскоп је такође врста оптичког микроскопа, углавном зато што је таласна дужина побуђена флуоресцентним микроскопом кратка, тако да то доводи до разлике у структури и употреби између флуоресцентног микроскопа и обичног микроскопа. Већина флуоресцентних микроскопа има добру функцију хватања слабе светлости, тако да је под изузетно слабом флуоресценцијом и његова способност снимања добра. Заједно са сталним побољшањем флуоресцентних микроскопа последњих година, бука је такође значајно смањена. Због тога се користи све више и више флуоресцентних микроскопа.
Познавање двофотонске флуоресцентне микроскопије
Основни принцип двофотонске ексцитације је: у случају велике густине фотона, флуоресцентни молекули могу истовремено да апсорбују два фотона дугих таласа и да емитују фотон краће таласне дужине након кратког периода живота у такозваном побуђеном стању. . ; ефекат је исти као коришћење фотона чија је таласна дужина половина дуге таласне дужине за побуђивање флуоресцентног молекула. Двофотонско побуђивање захтева велику густину фотона. Да не би оштетили ћелије, двофотонска микроскопија користи импулсне ласере са закључавањем мода високе енергије. Ласер који емитује овај ласер има високу вршну енергију и ниску просечну енергију, ширина импулса му је само 100 фемтосекунди, а фреквенција може да достигне 80 до 100 мегахерца. Када користите објектив објектива са високим нумеричким отвором за фокусирање фотона импулсног ласера, густина фотона у фокусној тачки сочива објектива је највећа, а двофотонско побуђивање се јавља само у фокусној тачки сочива објектива, тако да двофотонском микроскопу није потребан конфокални отвор, што побољшава ефикасност детекције флуоресценције.
У општим феноменима флуоресценције, због ниске густине фотона ексцитационе светлости, флуоресцентни молекул може да апсорбује само један фотон у исто време, а затим да емитује флуоресцентни фотон кроз радијациони прелаз, што је једнофотонска флуоресценција. За процес побуђивања флуоресценције коришћењем ласера као извора светлости, може доћи до двофотонске или чак вишефотонске флуоресценције. У овом тренутку, интензитет ексцитационог извора светлости који се користи је висок, а густина фотона задовољава захтеве флуоресцентних молекула који апсорбују два фотона у исто време. У процесу коришћења општег ласера као извора побудног светла, густина фотона још увек није довољна да произведе феномен двофотонске апсорпције. Обично се користи фемтосекундни пулсни ласер, а његова тренутна снага може достићи редослед мегавата. Према томе, таласна дужина двофотонске флуоресценције је краћа од таласне дужине ексцитационе светлости, што је еквивалентно ефекту који производи ексцитација на половини таласне дужине побуде.
Двофотонска флуоресцентна микроскопија има многе предности:
1) Светлост дугих таласа је мање под утицајем расејања од светлости кратког таласа и лако продире у узорак;
2) Флуоресцентни молекули изван фокалне равни нису побуђени, тако да више ексцитационе светлости може доћи до фокалне равни, тако да побудна светлост може продрети у дубље узорке;
3) Блиско инфрацрвено светло дугих таласа је мање токсично за ћелије од светлости кратких таласа;
4) Када се користе двофотонски микроскоп за посматрање узорака, фотобељење и фототоксичност се јављају само у фокалној равни. Због тога је двофотонска микроскопија прикладнија од једнофотонске микроскопије за посматрање дебелих узорака, за посматрање живих ћелија или за експерименте фотобељења на месту.
Познавање конфокалне флуоресцентне микроскопије
Основни принцип конфокалне флуоресцентне микроскопије: тачкасти извор светлости се користи за озрачивање узорка, а на фокалној равни се формира добро дефинисана мала светлосна тачка. састављена од разделника. Разделник снопа шаље флуоресценцију директно на детектор. Испред извора светлости и детектора налази се рупица, односно рупица за осветљење и рупица за детекцију. Геометријска величина ова два је иста, око 100-200нм; у односу на светлосну тачку на фокалној равни, ова два су коњугирана, то јест, светлосна тачка пролази кроз низ сочива и коначно може бити фокусирана на отвор за осветљење и отвор за детекцију у исто време. На овај начин, светлост из фокалне равни може да се конвергира у оквиру отвора за детекцију, док је расејана светлост изнад или испод жижне равни блокирана изван отвора за детекцију и не може се снимити. Ласер скенира узорак тачку по тачку, а фотомултипликаторска цев након детекције рупице такође добија конфокалну слику одговарајуће светлосне тачке тачку по тачку, која се претвара у дигитални сигнал и преноси на рачунар, и на крају агрегира у јасну конфокална слика целе фокалне равни на екрану .
Свака слика у фокалној равни је заправо оптички попречни пресек узорка. Овај оптички попречни пресек увек има одређену дебљину, познату и као оптички танак пресек. Пошто је интензитет светлости у жижној тачки много већи од интензитета у нефокусној тачки, а светлост у нефокалној равни филтрира рупица, дубина поља конфокалног система је приближно нула, а скенирање дуж З -оса може да реализује оптичку томографију, формирајући Посматрајте дводимензионални оптички пресек на фокусираном месту узорка. Комбинујући скенирање у равни КСИ (фокална раван) са скенирањем по З-оси (оптичка оса), тродимензионална слика узорка се може добити акумулацијом дводимензионалних слика континуалних слојева и обрадити посебним компјутерским софтвером.
То јест, рупица за детекцију и рупица извора светлости су увек фокусирани на исту тачку, тако да флуоресценција побуђена изван фокалне равни не може ући у рупицу за детекцију.
Једноставан израз принципа рада ласерског конфокалног је да користи ласер као извор светлости, а на основу традиционалног флуоресцентног микроскопа, додаје уређај за ласерско скенирање и коњуговани уређај за фокусирање, и представља систем за добијање дигиталне слике и обрада путем компјутерске контроле.
