Разлике и карактеристике између флуоресцентног микроскопа и обичног оптичког микроскопа
Флуоресцентни микроскоп се разликује од обичног оптичког микроскопа. Не посматра узорак кроз осветљење обичног извора светлости. Уместо тога, он користи светлост одређене таласне дужине (обично ултраљубичасто светло, плаво-љубичасто светло) да побуђује флуоресцентни материјал у узорку под микроскопом, узрокујући да емитује флуоресценцију. Дакле, извор светлости флуоресцентног микроскопа не служи као директно осветљење, већ као извор енергије који побуђује унутрашњи флуоресцентни материјал узорка. Разлог зашто можемо да посматрамо узорак није осветљење извора светлости, већ феномен флуоресценције узрокован флуоресцентним материјалом у узорку који апсорбује побуђену светлосну енергију. Може се видети да је главна карактеристика флуоресцентног микроскопа то што његов извор светлости може да обезбеди велику количину ексцитационе светлости у одређеном опсегу таласних дужина, тако да флуоресцентне супстанце у узорку који се испитују могу да добију неопходан интензитет ексцитационе светлости. Истовремено, флуоресцентни микроскопи морају имати одговарајуће системе филтера. Флуоресцентна микроскопија је суштински алат за напредну хистохемију флуоресценције. Састоји се од извора светлости ултра високог притиска, система филтера (укључујући филтерске плоче за побуђивање и потискивање), оптичког система и система за фотографисање. Користи светлост одређене таласне дужине да потакне узорак да емитује флуоресценцију.
1. Начини побуђивања флуоресценције: Према опсегу таласних дужина светлости, она се дели на два типа: УВ ексцитациони метод (користећи метод ултраљубичастог осветљења) и БВ метод ексцитације (користећи плаво-љубичасто светло). Метода УВ ексцитације користи скоро ултраљубичасто светло краће од 400нм за побуду. У овој методи нема видљиве ексцитационе светлости, тако да посматрана флуоресценција показује инхерентну флуоресценцију боје, што олакшава разликовање специфичне флуоресценције на узорку од аутофлуоресценције позадинског ткива.
2. БВ метода ексцитације: ексцитација од ултраљубичастог до плавог светла са центром на 404нм и 434нм. Ова метода користи плаво светло за осветљавање узорка, тако да гранични филтер система за посматрање флуоресценције мора да користи филтер који може у потпуности да блокира плаво светло и у потпуности прође потребну зелену и жуту флуоресценцију. Флуоресцентне боје које се користе у методама флуоресцентних антитела. Максимална таласна дужина апсорпције ексцитационе светлости и максимална таласна дужина емисије флуоресценције су релативно близу, тако да филтер који се користи у БВ методи ексцитације мора да користи оштар филтер за одсецање. Овај метод може користити плаво светло као побудно светло, тако да је ефикасност апсорпције флуоресцентних пигмената већа и могу се добити светлије слике. Недостатак је што се флуоресценција испод 500нм не може видети, док флуоресценција изнад 500нм чини да цела слика изгледа жуто. У методи флуоресцентних антитела, специфичност флуоресцентне боје се углавном оцењује по њеној јединственој боји. Стога, када се говори о суптилној специфичности, горе поменути недостаци методе БВ ексцитације често имају велики утицај.
