Колико знате о флуоресцентној микроскопији
Флуоресцентни микроскопи углавном користе живине лампе високог интензитета као изворе ексцитационог светла. Филтери се користе за филтрирање нежељене светлости, остављајући само чисту светлост високог интензитета која побуђује флуорофор. Након што монохроматска светлост озрачи узорак кроз сочиво објектива, узорак ће бити узбуђен да емитује светлост (флуоресценција), а и флуоресценција и ексцитационо светло ће се вратити дуж оптичке путање сочива објектива. У овом случају, потребно је дихроично огледало за филтрирање побудног светла. , пропуштајући само флуоресценцију коју треба да видимо.
Ова флуоресценција стиже до окулара дуж светлосне путање микроскопа, а затим улази у наше очи, где можемо видети флуоресценцију коју емитује флуорофор.
Претходна провера и подешавање флуоресцентног микроскопа:
(1) Пре сваког посматрања флуоресценције, неопходно је рутински проверавати поравнање филамента, фокус оптичке путање, дијафрагму отвора и подешавања дијафрагме поља флуоресцентног уређаја.
(2) Да ли је потребан склоп флуоресцентног побуђивања/емисионог филтера инсталиран у претварач, да ли је сочиво објектива флуоресцентног микроскопа правилно конфигурисано и да ли је уклоњене мрље од уља и прашине на предњем сочиву објектива.
(3) Ако се истовремено врши посматрање фазног контраста пропуштене светлости, потребно је проверити коњугацију центра кондензатора и фазног контрастног прстена супротно од сочива објектива.
(4) Проверите да ли је носач узорка (клизно стакло, покровно стакло и други прибор) прекривен течношћу или прашином и да ли је дебљина унутар калибрисаног опсега радног растојања сочива објектива. Исечени узорак не би требало да буде превише дебео, пожељно мањи од или једнак 10 μм.
(5) Пошто извор осветљења садржи ултраљубичасте зраке, смеђа плоча за заштиту од светлости се поставља изнад предњег дела бине како би се спречило да ултраљубичасти зраци оштете мрежњачу.
(6) Нестабилност напона ће смањити радни век живине лампе високог притиска, а напајање извора светлости је опремљено стабилизатором напона.
(7) Да би се продужио животни век живине лампе, може се искључити 15 минута након што се укључи; када се флуоресцентна снага живине лампе искључи, потребно је да сачека најмање 10 минута да поново покрене живину пару да се охлади и врати у првобитно стање, иначе ће то утицати на живот лампе.
Посматрање слике помоћу флуоресцентног микроскопа:
(1) Отприлике 5-10 минута након укључивања флуоресцентног извора светлости, интензитет ексцитационог светла има тенденцију да буде стабилан, а узорак се пуни за посматрање; да би се спречило гашење флуоресценције узорка изазвано прекомерном ексцитацијом светлости током процеса фокусирања и тражења објеката, прво умањите флуоресцентни микроскоп. Подесите ексцитационо светло на умерени интензитет помоћу дијафрагме са отвором или додајте НД филтер, и редовно померајте фазу узорка. Након што потврдите слику у огледалу, подесите флуоресцентно стање за снимање и снимање.
(2) Подешавања за лош квалитет слике. Поред фактора припреме узорка, неопходна подешавања која се могу извршити су:
① Изузмите уређаје који штите или ограничавају светлост у оптичкој путањи за снимање, као што су ДИЦ додаци, НД филтери итд.
②Поново подесите фокус пријемника и величину дијафрагме отвора бленде флуоресцентног микроскопа.
③ Пажљиво подесите прстен за корекцију разлике у покривености сочива објектива флуоресцентног микроскопа.
Тачке примене флуоресцентне микроскопије
Флуоресцентна микроскопија користи снимање "актиничке флуоресценције". Ако је изабрана таласна дужина побуде у скоро ултраљубичастом региону (320-400нм), који је невидљив голим оком, емисиони спектар флуоресценције је такође краћи од просечне таласне дужине обичних извора светлости у огледалу. побољшати. Високоенергетски фотони се сударају са електронима, што доводи до преласка електрона из основног у побуђено стање. Електрони у побуђеном стању су веома нестабилни и вратиће се у основно стање. У овом процесу ће се потрошити део топлотне енергије и емитовати нови фотони. Нови фотон има нижу енергију од оригиналног фотона и стога има већу таласну дужину. Пошто је нова таласна дужина фотона различита од таласне дужине фотона упадне светлости, два снопа светлости различитих таласних дужина се одвајају одређеним методом оптичке обраде, тако да видимо само емитоване нове фотоне (флуоресцентни сигнал), тј. флуоресцентни микроскоп види флуоресцентне слике.
