Знање о дво{0}}фотонској флуоресцентној микроскопији
Основни принцип побуђивања са два{0}}фотона је да при великој густини фотона, флуоресцентни молекули могу истовремено да апсорбују два фотона дуге таласне дужине и да емитују фотон краће таласне дужине након кратког периода такозваног животног века-побуђеног стања; Ефекат је исти као коришћење фотона са половином таласне дужине дуге таласне дужине за побуђивање флуоресцентних молекула. Побуђивање са два фотона захтева високу густину фотона, а да би се избегло оштећење ћелија, двофотонска микроскопија користи ласере са закључаним пулсом са високим{4}}енергијским режимом{5}}. Ласер који емитује овај ласер има високу вршну енергију и ниску просечну енергију, са ширином импулса од само 100 фемтосекунди и фреквенцијом од 80 до 100 мегахерца. Када користите сочиво објектива са великим нумеричким отвором за фокусирање фотона импулсног ласера, густина фотона у жижној тачки сочива објектива је највећа, а побуђивање два-фотона се јавља само у жижној тачки сочива објектива. Због тога, дво-микроскопу није потребан конфокални отвор, што побољшава ефикасност детекције флуоресценције.
У општим феноменима флуоресценције, због ниске густине фотона ексцитационе светлости, флуоресцентни молекул може да апсорбује само један по један фотон, а затим да емитује други флуоресцентни фотон кроз радијациони прелаз, што је познато као флуоресценција једног фотона. За процесе побуђивања флуоресценције који користе ласере као изворе светлости, може доћи до појаве дво-фотона или чак вишефотонске флуоресценције. У овом случају, коришћени ексцитациони извор светлости има висок интензитет и густину фотона који испуњава захтев да флуоресцентни молекули апсорбују два фотона истовремено. У процесу коришћења општег ласера као покретачког извора светлости, густина фотона је још увек недовољна да произведе феномен апсорпције два{4}}фотона. Обично се користе фемтосекундни пулсни ласери, са тренутном снагом која достиже ниво мегавата. Према томе, таласна дужина флуоресценције са два-фотона је краћа од таласне дужине ексцитационе светлости, што је еквивалентно ефекту изазваном побуђивањем таласном дужином пола побуђења.
