Познавање конфокалног флуоресцентног микроскопа
Основни принцип конфокалне флуоресцентне микроскопије: тачкасти извор светлости се користи за озрачивање узорка, формирајући малу, добро дефинисану тачку светлости на фокалној равни; флуоресценцију која се емитује из ове тачке након озрачивања сакупља сочиво објектива и шаље назад дуж првобитне путање светлости зрачења до разделника снопа који се састоји од двосмерног хроматског огледала. Разделник снопа шаље флуоресценцију директно на детектор. И извор светлости и детектор имају рупицу испред себе, која се назива рупица за осветљење и рупица за детекцију, респективно. Обе имају исту геометрију, око 100-200 нм, и коњугиране су у односу на тачку светлости на жижној равни, тј. светлосна тачка пролази кроз низ сочива и на крају се може фокусирати на оба светлећа и рупице детектора. На овај начин, светлост из фокалне равни може конвергирати унутар отвора сонде, док је расејана светлост изнад или испод фокалне равни блокирана изван отвора сонде и не може се снимити. Ласер скенира узорак тачку по тачку, а фотомултипликаторска цев након детекције рупице такође добија конфокалну слику одговарајуће светлосне тачке тачку по тачку, која се претвара у дигитални сигнал и преноси на рачунар и коначно конвергира у јасну конфокална слика целе фокалне равни на екрану.
Свака слика у фокалној равни је заправо оптички попречни пресек узорка, а овај оптички пресек увек има одређену дебљину, познату и као оптички лист. Пошто је интензитет светлости у жижној тачки много већи од оног у нефокалној тачки, а светлост у нефокалној равни филтрира рупица, дубина поља конфокалног система је приближна нули, а скенирање дуж правца З-осе омогућава оптичкој томографији да формира дводимензионални оптички пресек узорка који се посматра на жаришту. Комбиновањем скенирања у равни КСИ (фокална раван) са скенирањем по З-оси (оптичка оса), тродимензионална слика узорка се може добити акумулацијом узастопних слојева дводимензионалних слика, које се обрађују специјализованим рачунарским софтвером.
То значи да су рупица за детекцију и рупица извора светлости увек фокусирана на истој тачки, тако да флуоресценција побуђена изван фокалне равни не може да уђе у рупицу за детекцију.
Принцип рада ласерског конфокалног једноставно се изражава да користи ласер као извор светлости, на основу традиционалног флуоресцентног микроскопског снимања, додатног уређаја за ласерско скенирање и коњугованог уређаја за фокусирање, путем компјутерске контроле за спровођење дигиталног система за аквизицију и обраду слике.
