Знања везана за конфокалну флуоресцентну микроскопију
Основни принцип конфокалне флуоресцентне микроскопије је да се користи тачкасти извор светлости за озрачивање узорка, формирајући добро дефинисану малу тачку на фокалној равни. Флуоресценцију коју емитује тачка након озрачивања сакупља сочиво објектива и шаље назад у спектрофотометар састављен од двосмерног огледала у боји дуж оригиналне путање зрачења. Спектрофотометар шаље флуоресценцију директно на детектор. Испред извора светлости и детектора постоје две рупице, односно рупице за осветљење и рупице за детекцију. Геометријске димензије ова два су конзистентне, око 100-200нм; У поређењу са светлосном тачком на фокалној равни, ова два су коњугирана, што значи да светлосна тачка пролази кроз низ сочива и на крају се може истовремено фокусирати и на отвор за осветљење и на отвор за детекцију. На овај начин, светлост из фокалне равни може да конвергира у опсегу отвора за детекцију, док је расејана светлост изнад или испод жижне равни блокирана изван отвора за детекцију и не може се снимити. Скенирањем узорка тачку по тачку ласером, фотомултипликаторска цев након детекције рупице такође добија одговарајућу конфокалну слику тачке по тачку светлости, која се претвара у дигитални сигнал и преноси на рачунар. Коначно, на екрану се синтетише јасна конфокална слика целе фокалне равни.
Свака слика у фокалној равни је заправо оптички попречни пресек узорка, који увек има одређену дебљину, познат и као оптички танак пресек. Због чињенице да је интензитет светлости у фокусној тачки много већи од интензитета у нефокалној тачки, а светлост у нефокалној равни се филтрира рупицама, дубина поља конфокалног система је приближно нула. Скенирањем дуж правца З-осе може се постићи оптичка томографија, формирајући дводимензионални оптички пресек у фокусној тачки посматраног узорка. Комбиновањем скенирања у КСИ равни (фокална раван) са скенирањем по З-оси (оптичка оса), тродимензионална слика узорка се може добити акумулацијом континуалних слојева дводимензионалних слика и њиховом обрадом специјализованим компјутерским софтвером.
Рупа за детекцију и рупица извора светлости су увек фокусирани на исту тачку, тако да флуоресценција побуђена изван равни фокусирања не може ући у рупицу за детекцију.
Једноставан израз принципа рада ласерске конфокалне микроскопије је да користи ласер као извор светлости и додаје уређај за ласерско скенирање и коњуговани уређај за фокусирање на основу традиционалне флуоресцентне микроскопије. То је систем којим управља компјутер за добијање и обраду дигиталне слике.
