Ласерска конфокална микроскопија - карактеристике и примене
Ласерска скенирајућа конфокална микроскопија (ЛСЦМ) је тип микроскопа дизајнираног на основу технологије коњугованог фокуса, то јест, ласерски извор светлости, узорак који треба да се мери и детектор су сви у коњугованим позицијама један са другим.
Фундаментално
У општем микроскопу, раван слике посматрања је изолована од суседне аксијалне равни тако што се жижна раван сочива објектива поклапа са детектором, док се у конфокалном микроскопу светлосна тачка ограничена дифракцијом користи за осветљавање узорка и А пинхоле се користи у сакупљеној путањи светлости на коњугованом фокусу светлосне тачке за филтрирање расуте светлости да би се створио овај ефекат изолације и тиме побољшала резолуција.
Карактеристике сликања
Скенирање оптичког пресека
Још једна карактеристика ласерске скенирајуће конфокалне микроскопије је да је то технологија скенирања слике. Традиционална технологија осветљења широког поља осветљава цео узорак, тако да се слика може снимити директно голим оком или детектором, али ЛСЦМ користи сноп или вишеструки фокусирани снопови пролазе кроз узорак за скенирање и снимање. Добијена слика се назива оптички пресек. Следеће показује разлику између традиционалне методе осветљења широког поља и методе конфокалног осветљења ласерског скенирања.
Стога је стварна метода рада модерног конфокалног микроскопа као што је приказано на слици испод. Побуђена светлост коју емитује ласер пролази кроз дихроично огледало и скенира се у к и и смеру узорка кроз пар галванометара. Ексцитација (или рефлексија) узорка је Светлост која улази у ПМТ детектор кроз рупицу и снима се, а снимљена скенирана слика се реконструише од стране компјутера да би се реконструисала стварна слика узорка.
Генеришите "з-стацк" слике на различитим фокалним равнима
Само светлост која се рефлектује од коњугованог слоја узорка може да прође кроз малу рупу на путањи сабирне светлости, а преостале ирелевантне рефлексије слоја узорка су блокиране малом рупом. Ово може довести до значајних побољшања резолуције. Упоредно поређење мултидимензионалне флуоресцентне микроскопије и конфокалне микроскопије истог дебелог узорка. Када се направи серија слика у различитим фокалним равнима, могу се генерисати слике које се обично називају "з-стекови", који илуструју добитке резолуције и контраста које нуди конфокална микроскопија и основне узроке ових добитака. Може се видети да испитивање слике на врху хрпе са равнином за снимање изнад ткива открива велику количину распршене светлости на флуоресцентној слици, док слика конфокалне микроскопије изгледа црна. Ово смањење аксијалног ПСФ-а директно доводи до разлике у резолуцији уоченој на оптичком интерфејсу у средини з-стека.
Резолуција је знатно побољшана у поређењу са широком расветом
У флуоресцентној микроскопији, интензитет светлости који се емитује из једне тачке је описан функцијом ширења тачке (ПСФ), а њен образац је Аири диск. Резолуција флуоресцентног система може се описати радијусом Еријевог диска, који се може описати као Нумерички отвор објектива и таласна дужина ексцитационог светла одређују
