Ниска цена флуоресценције и дизајн микроскопа са светлим пољем
У овом водичу ћу размотрити основне принципе флуоресцентне микроскопије и начин на који се конструишу три различита јефтина флуоресцентна микроскопа. Ови системи обично коштају хиљаде долара, али недавни напори су олакшали њихово добијање. Дизајн који овде представљам користи паметне телефоне, дСЛР и УСБ микроскопе. Сви ови дизајни се такође могу користити као микроскопи отвореног поља.
Корак 1: Преглед флуоресцентне микроскопије
Да бисте разумели основне концепте флуоресцентне микроскопије, замислите густе шуме, дрвеће, животиње, жбуње и друге шуме које живе у шуми ноћу. Ако упалите батеријску лампу у шуму, видећете све ове структуре и тешко је замислити одређене животиње или биљке. Под претпоставком да сте заинтересовани само да видите грмове боровнице у шуми. Да бисте то постигли, потребно је да обучите кријеснице да их привлаче само грмови боровнице, тако да када погледате у шуму, светлеће само грмови боровнице. Можете рећи да сте грмове боровнице обележили кријесницама, па можете видети структуре боровнице у шуми.
У овој аналогији, шума представља цео узорак, жбун боровнице представља структуру коју желите да визуелизујете (као што су специфичне ћелије или субћелијске органеле), а кријеснице су флуоресцентна једињења. Ситуација снимања батеријске лампе сама без кријесница је слична микроскопу са светлим пољем.
Следећи корак је разумевање основних функција флуоресцентних једињења (познатих и као флуорофори). Флуоресцентни кластери су заправо мали објекти (наноскали) дизајнирани да повежу специфичне структуре у узорку. Они апсорбују светлост уског опсега таласних дужина и поново емитују светлост друге таласне дужине. На пример, флуоресцентна група може да апсорбује плаво светло (тј. флуоресцентна група је побуђена плавом светлошћу), а затим поново емитује зелено светло. Обично се ово сумира кроз спектре ексцитације и емисије (као што је приказано на горњој слици). Ови графикони показују таласне дужине светлости коју апсорбује флуорофор и таласне дужине светлости коју емитује флуорофор.
Дизајн микроскопа је веома сличан оном обичног микроскопа отвореног поља, са две главне разлике. Прво, светлост која осветљава узорак мора бити на таласној дужини побуђене флуоресцентне групе (за пример изнад, светло је плаво). Друго, микроскоп треба само да прикупи емитовано светло (зелено светло) док блокира плаво светло. То је зато што је плаво светло свуда, али зелено долази само из одређених структура у узорку. Да би блокирали плаво светло, микроскопи обично имају нешто што се зове филтер дугог пролаза који дозвољава зеленом светлу да прође без плаве светлости. Сваки дугопропусни филтер има граничну таласну дужину. Ако је таласна дужина светлости већа од граничне таласне дужине, она може проћи кроз филтер. Дакле, назив је "Лонг Дистанце Пасс". Краће таласне дужине су блокиране.
Корак 2: Моделирање микроскопа помоћу оптичке оптике
Ово је додатни корак у пројектовању основног принципа микроскопа. Нема потребе за прављењем флуоресцентног микроскопа, тако да ако не желите да улазите у оптику, можете то прескочити.
И микроскопи са светлим пољем и флуоресцентни микроскопи могу се моделовати помоћу оптичких уређаја. Основна премиса зрачне оптике је да је понашање светлости слично понашању светлости која се шири од извора светлости. Када погледате по соби, видећете сунчеву светлост изван прозора или светлост коју доноси сијалица. Тада се светлост апсорбује или одбија од предмета у просторији. Нешто рефлектоване светлости ће га окренути према вашим очима. Ако је објекат осветљен, можете замислити да свака тачка на објекту емитује светлост у свим правцима (као што је приказано на горњој слици). Сочиво, као и сочиво у нашим очима, фокусира светлост на тачку тако да можемо да видимо објекат. Без сочива, светлост наставља да се шири напоље и не формира слику.
