Учионица за микроскопско снимање丨Примена флуоресцентне микроскопије
Флуоресцентна микроскопија са тоталном унутрашњом рефлексијом (ТИРФМ) је техника која користи еванесцентни талас генерисан светлосним снопом који се шири између два различита медија индекса преламања да би се испитала површина флуоресцентно обележених живих ћелија. У пракси, када упадни ласерски сноп наиђе на интерфејс између покровног стакла и воденог медијума који садржи ћелије, он се рефлектује под критичним углом (тотална унутрашња рефлексија). Пошто енергија еванесцентног таласа опада експоненцијално са растојањем од покровног стакала, само флуорофори унутар 10 нанометара од површине (између 10 и 200 нанометара) су побуђени пролазним таласом, док су флуорофори који су удаљенији углавном непобуђени. Под утицајем. Дакле, ТИРФМ резултира високим нивоима сигнала из флуорофора који се налазе у близини покровног стакла, постављених на веома тамној позадини, обезбеђујући одличан однос сигнал-шум. Екстремно ограничење дубине ексцитације је идеално за проучавање појединачних молекула или састава мембране и органела у прилепљеним ћелијама у близини површине покровног стакла (види слику 8(е)). Пошто је ексцитација ограничена на танке регионе у близини покровног стакала, фотобељење и фототоксичност су такође ограничени на ове регионе, што ТИРФМ чини једном од најкориснијих метода за дугорочно посматрање. Техника је постала основно средство за проучавање широког спектра феномена у ћелијској и молекуларној биологији.
Деконволуција је алгоритам који се примењује на скуп слика са свим фокусом добијених дуж оптичке (З) осе да би се побољшао фотонски сигнал у низу слика за дату раван слике или више фокалних равни. Микроскопи морају бити опремљени моторизованим погонима за фокусирање високе прецизности како би се гарантовала аквизиција слике у тачно дефинисаним интервалима између фокалних равни узорка. У типичној примени (видети Слику 8(ф)), процес деконволуције се користи за уклањање замућења и уклањање светлости ван фокуса из дате фокалне равни коришћењем ексцитације и емисије широког поља флуоресценције. Најкомплекснија примена је да примените процес деконволуције на цео стог слика да бисте генерисали пројектоване погледе или 3Д моделе. Скуп слика широког поља који се користи за деконволуцију хвата теоретски максимални број фотона које емитује узорак. Процес деконволуције редистрибуира "замућене" интензитете фотона емитованих изнад и испод фокалне равни назад у првобитну раван. Дакле, деконволуција користи скоро све доступне интензитете емисије и обезбеђује оптималан буџет светлости, што ову технику чини методом избора за узорке веома осетљиве на светлост.
За добијање квантитативних временских и просторних информација о везивању и интеракцији протеина, липида, ензима и нуклеинских киселина у живим ћелијама користи се варијанта феномена резонантног преноса енергије на флуоресцентној микроскопији, флуоресценцији или Форстер резонантном преносу енергије (ФРЕТ). ФРЕТ може да користи технике у константном стању или временско разрешене технике, али временски решено ФРЕТ снимање има предност у прецизнијем мапирању удаљености донор-акцептор. Стандардни флуоресцентни микроскоп широког поља опремљен одговарајућим ексцитационим и емисионим филтерима и осетљивом камером се може користити за ФРЕТ снимање. Биосензори који стављају еколошки осетљив протеин или пептид између два флуоресцентна протеина који се примењују на ФРЕТ тренутно се широко користе у ћелијској биологији. Ове сонде се лако снимају под флуоресцентном микроскопијом широког поља коришћењем сензибилизованих емисионих ФРЕТ техника у комбинацији са рациометријском анализом. Поред тога, спектрално снимање и линеарно немешање коришћењем конфокалне микроскопије за ласерско скенирање могу помоћи у праћењу ФРЕТ феномена у биосензорима и другим апликацијама флуоресцентних протеина.
Флуоресцентна микроскопија за време трајања слике (ФЛИМ) је софистицирана техника способна да истовремено сними животни век флуоресценције и просторну локацију флуорофора на свакој локацији на слици. Овај метод обезбеђује механизам за проучавање параметара животне средине као што су пХ, концентрација јона, поларитет растварача, нековалентне интеракције, вискозитет и тензија кисеоника у појединачним живим ћелијама и представља податке у просторним и временским низовима. ФЛИМ мерења животног века побуђеног стања на наносекундној скали су независна од локалних концентрација флуорофора, ефеката фотобељења и дужине путање (дебљине узорка), али су осетљива на реакције побуђеног стања као што је пренос резонантне енергије. У ствари, комбиновање ФЛИМ-а са ФРЕТ-ом праћењем животних промена флуоресцентних донора пре и после резонантног преноса енергије сматра се једним од најбољих начина за проучавање овог феномена.
Покретљивост (попречни коефицијент дифузије) флуоресцентно обележених макромолекула и малих флуорофора може се одредити флуоресцентним обнављањем након технике фотобељења (ФРАП). Код ФРАП-а, веома мала одабрана област (пречника неколико микрометара) се интензивно осветљава, обично ласером, да би се дошло до потпуног фотоизбељивања флуорофора у тој области. Резултат је драматично смањење или поништавање флуоресценције. Након импулса фотобељења, брзина и обим опоравка интензитета флуоресценције у избељеним регионима праћени су као функција времена при ниским интензитетима ексцитације да би се генерисале информације о кинетици репопулације и опоравка флуорофора (Слика 9). ФРАП се обично изводи помоћу ЕГФП или других флуоресцентних протеина. Сродне технике фотоактивације су засноване на специјалним синтетичким флуорофорима у кавезима или слично функционалним флуоресцентним протеинима који се могу активирати кратким импулсима УВ или љубичастог зрачења. Фотоактивација и ФРАП се могу користити као комплементарне технике за одређивање параметара мобилности.
У техници која се односи на ФРАП, која се зове губитак флуоресценције након фотобељења (ФЛИП), дефинисани флуоресцентни регион унутар живе ћелије подлеже поновљеном фотоизбељивању интензивним зрачењем. Ако би сви флуорофори успели да дифундују у област која се избељује током мереног временског периода, то би резултирало потпуним губитком флуоресцентног сигнала у целој ћелији. Израчунавањем брзине којом флуоресценција нестаје из целе ћелије, може се одредити дифузиона покретљивост циљног флуорофора. Поред тога, ФЛИП може лако да идентификује локацију и природу било које дифузионе баријере између појединачних одељака ћелија, као што је баријера између соме и аксона неурона.
Флуоресцентна корелациона спектроскопија (ФЦС), која се углавном користи у конфокалној микроскопији за ласерско скенирање или мултифотонској микроскопији, је метода дизајнирана да одреди кинетичке информације као што су брзине хемијских реакција, коефицијенти дифузије, технике за молекуларну тежину, брзину протока и агрегацију. У ФЦС, мала запремина (отприлике један фемтометар; фокус ласера са ограниченом дифракцијом) је осветљен фокусираним ласерским снопом да би се забележиле флуктуације интензитета аутофлуоресценције изазване динамиком флуоресцентних молекула у функцији времена у запремини коју заузима флуоресцент молекула (слика 10). Релативно мали флуорофори брзо дифундују у осветљеној запремини, производећи кратке рафале насумичног интензитета. Супротно томе, већи комплекси (флуорофори везани за макромолекуле) се крећу спорије, производећи дуже, упорније обрасце интензитета флуоресценције зависне од времена.
Када су флуоресцентно обележене структуре густо упаковане и преклапају се у одређеним регионима живих ћелија, њихову динамику и просторну дистрибуцију је тешко анализирати. Флуоресцентна спот микроскопија (ФСМ) је техника компатибилна са скоро свим модалитетима снимања која користи предности веома ниске концентрације флуоресцентно обележених подјединица, смањује флуоресценцију ван фокуса и побољшава видљивост обележених структура и њихову динамику у дебелим регионима. ФСМ се имплементирају тако што се означава само делић целокупне структуре од интереса. У том смислу, ФСМ је сличан извођењу ФЦС-а у целом видном пољу, иако ставља већи нагласак на просторне обрасце, а не на квантитативну временску анализу. Флуоресцентна спот микроскопија је посебно корисна у одређивању покретљивости и агрегације елемената цитоскелета као што су актин и микротубуле у хиперактивним ћелијама.
Микроскопија са осиромашењем стимулисане емисије (СТЕД) је нова техника супер-резолуције са просторном резолуцијом далеко изнад границе дифракције, користећи осиромашено светло у облику прстена да окружи мањи сноп ексцитационе светлости да би се добио суб-50 нм на оси до резолуцију. Техника се ослања на ексцитацију флуорофора са синхронизованим ласерским импулсима и просторно координисаним кружним СТЕД импулсима који исцрпљују емитовано светло, потискујући флуоресценцију побуђених молекула око фокуса ласерског скенирања. Флуоресценција створена на периферији тачке је потиснута, али не и у центру тачке, чиме се значајно смањује величина флуоресцентне тачке и сходно томе значајно повећава резолуција. СТЕД се показао као користан алат за детекцију живих ћелија високе резолуције. Друге нове технике супер-резолуције, као што су фотоактивирана локализациона микроскопија (ПАЛМ) и микроскопија са структурираним светлосним осветљењем (СИМ), такође ће постати основни алати за снимање живих ћелија у блиској будућности.
Све већа употреба генетски кодираних флуоресцентних протеина и напредних синтетичких флуорофора за снимање живих ћелија отвара врата новим оптичким модалитетима за праћење временске динамике и просторних односа. Микроскописти сада имају комплетан скуп алата за посматрање и снимање сликовних података ћелијских процеса који се дешавају у широком распону временских размака и у више резолуција. Спорији догађаји се могу лако посматрати и снимити помоћу ласерске скенирајуће конфокалне микроскопије, док се бржи кинетички догађаји могу добити коришћењем технологије ротирајућих дискова. Поред тога, мултифотонска микроскопија омогућава дубоко снимање у дебелим ткивима, а технике тоталне унутрашње рефлексије омогућавају сондирање површина мембране са конфокалном прецизношћу. Напредне методе флуоресценције, као што су ФРЕТ, ФЛИМ, ФРАП, ФЦС, ФСМ, СИМ, ПАЛМ и СТЕД, могу се користити за праћење интеракција протеин-протеин при резолуцијама често бољим од оних које дозвољава граница дифракције. Са напретком у технологији флуорофора, микроскопа и детектора, шири свет ће бити доведен "под микроскоп".
