Принципи конфокалне микроскопије
Конфокални микроскоп је инструмент за снимање високе прецизности који се појавио и развио 1980-их, и представља суштински научно-истраживачки инструмент за проучавање субмикронских структура. Са развојем рачунара, софтвера за обраду слике и ласера, конфокални микроскопи су такође доживели велики развој, и сада се широко користе у областима биологије, микросистема и мерења материјала. Конфокални микроскоп је нова врста микроскопа који интегрише конфокални принцип, технологију скенирања и технологију обраде компјутерске графике. Његове главне предности су: висока латерална резолуција и висока аксијална резолуција, као и ефикасно сузбијање расуте светлости, са високим контрастом.
Типична поставка конфокалног микроскопа је постављање две мале рупе на коњуговану раван фокалне равни мерног објекта, од којих је једна постављена испред извора светлости, а друга испред детектора, као што је приказано на слици. 1. Са слике се може видети да када се мерени узорак налази у квази-фокусној равни, интензитет светлости прикупљен на крају детекције је највећи; када је измерени узорак у положају ван фокуса, светлосна тачка на крају детекције се дифундује и интензитет светлости се брзо смањује. Дакле, само светлост коју емитују тачке на жижној равни може да прође кроз излазну рупицу, док је светлост коју емитују тачке ван жижне равни дефокусирана на излазну пинхоле раван, и већина њих не може да прође кроз централну рупицу. Због тога, циљна тачка посматрања у жижној равни изгледа светла, а тачка која се не посматра постаје црна као позадина, повећавајући контраст и чисти слику. Током процеса снимања, две рупице су конфокалне, конфокална тачка је детектована тачка, а раван у којој се детектована тачка налази је конфокална раван.
Величина отвора на детектору у конфокалној микроскопији игра кључну улогу. Он директно утиче на резолуцију и однос сигнал-шум система. Ако је рупица превелика, неће се постићи ефекат конфокалне детекције, што не само да смањује резолуцију система, већ и уводи више расуте светлости; ако је рупица премала, то ће смањити ефикасност детекције и смањити микроскопску слику. осветљеност. Студије су показале да када је пречник рупице једнак пречнику Аири диска, конфокални захтеви су испуњени, а ефикасност детекције није значајно смањена. Пошто је пречник рупице генерално реда микрона, ако постоји одступање између тачке фокуса ласерског зрака и положаја рупице, доћи ће до изобличења сигнала. Стога, конфокални микроскопи углавном користе систем аутофокуса, који практично повећава време мерења.
Пошто је ласерски конфокални скенирајући микроскоп тачкасто снимање, да би се добила дводимензионална слика објекта, неопходно је користити дводимензионално скенирање у к и и правцима. Различити микроскопи користе различите методе скенирања:
(1) Скенирање објеката. То јест, сам објекат се креће по одређеном закону, док светлосни сноп остаје непромењен. Предности: стабилна оптичка путања; Недостаци: потребна је велика табела за скенирање, тако да је брзина скенирања веома ограничена.
(2) Систем за скенирање снопа се формира коришћењем рефлективног галванометра. То јест, контролом галванометра за скенирање, фокусирана светлосна тачка се редовно рефлектује на одређени слој објекта како би се завршило дводимензионално скенирање. Његова предност је у томе што има високу прецизност и често се користи за мерење високе прецизности. Брзина скенирања је побољшана у односу на скенирање објеката, али и даље није брзо.
(3) Користите акусто-оптички елемент за скретање за скенирање, а скенирање се реализује променом излазне фреквенције звучног таласа, а затим променом правца преноса светлосног таласа. Његова изузетна предност је што је брзина скенирања веома велика. Систем за скенирање који су развиле Сједињене Државе користи акусто-оптички дефлектор за генерисање видео слика у реалном времену. За скенирање дводимензионалне слике потребно је само 1/30 с, а резултат се скоро постиже у реалном времену.
(4) Нипков скенирање диска. Процес скенирања се завршава ротирањем Нипков диска док остале компоненте остају мирне. Може се сликати у једном тренутку и брзина је веома велика. Међутим, пошто је сноп слике ван осе светлости, аберација сочива ван осе мора да се исправи, а стопа коришћења светлосне енергије је веома ниска.
