Принципи флуоресцентне микроскопије
Флуоресцентни микроскопи се разликују од обичних оптичких микроскопа. Уместо да посматрају узорке под осветљењем обичних извора светлости, они користе светлост одређене таласне дужине (обично ултраљубичасто светло, плаво-љубичасто светло) да побуђују флуоресцентне супстанце у узорцима под микроскопом како би их натерали да емитују флуоресценцију. Стога, извор светлости флуоресцентног микроскопа не функционише као директно осветљење, већ као извор енергије који побуђује флуоресцентне супстанце унутар узорка. Разлог зашто можемо да посматрамо узорак је због осветљења извора светлости, али феномен флуоресценције који се појављује након што флуоресцентна супстанца у узорку апсорбује побуђену светлосну енергију.
Види се да је карактеристика флуоресцентног микроскопа да његов извор светлости може да обезбеди велику количину ексцитационе светлости у одређеном опсегу таласних дужина, тако да флуоресцентна супстанца у испитиваном узорку може да добије ексцитационо светло потребног интензитета. Истовремено, флуоресцентни микроскоп мора имати одговарајући систем филтера.
Флуоресцентна микроскопија је суштински алат у имунофлуоресцентној хистохемији. Састоји се од ултрависоког извора светлости, система филтера (укључујући филтерску плочу за побуђивање и потискивање), оптичког система и система за фотографисање и других главних компоненти. Користи светлост одређене таласне дужине да потакне узорак да емитује флуоресценцију.
Начин побуђивања флуоресценције: Према опсегу таласне дужине светлости, може се поделити на два типа: УВ ексцитациони метод (користећи метод ултраљубичастог осветљења) и БВ метод ексцитације (користећи плаво-љубичасто светло). Метода УВ ексцитације користи скоро ултраљубичасто светло краће од 400нм за побуду. У овој методи нема видљиве ексцитационе светлости, тако да посматрана флуоресценција представља инхерентну флуоресценцију боје и лако је разликовати специфичну флуоресценцију на узорку од аутофлуоресценције позадинског ткива.
БВ метода ексцитације је заснована на 404нм и 434нм за ексцитацију од ултраљубичастог до плавог светла. Ова метода користи плаво светло за озрачивање узорка, тако да гранични филтер система за посматрање флуоресценције мора да користи филтер који може у потпуности да блокира плаво светло и у потпуности прође потребну зелену и жуту флуоресценцију. Флуоресцентне боје за тестове флуоресцентних антитела. Максимална таласна дужина апсорпције ексцитационе светлости је релативно близу максималној таласној дужини емисије флуоресценције, тако да филтер који се користи у БВ методи ексцитације мора да користи оштар филтер за одсецање. Овај метод може користити плаво светло као побудно светло, тако да је ефикасност апсорпције флуоресцентног пигмента већа, а може се добити светлија слика. Његов недостатак је што се флуоресценција испод 500 нм не може видети, а флуоресценција изнад 500 нм чини да цела слика изгледа жуто. У методи флуоресцентног антитела, специфичност флуорохрома се често процењује према боји јединственој за флуорохром. Стога, када се говори о суптилној специфичности, горе поменути недостаци методе БВ ексцитације често имају велики утицај.
Да сумирамо, осветљење флуоресцентног микроскопа се може посматрати према следеће три тачке према структури кондензатора и таласној дужини ексцитационог светла.
① Из перспективе захтева за контрастом флуоресцентне слике, УВ ексцитациони концентратор тамног поља се користи за осветљење.
② Узимајући у обзир осветљеност слике, БВ ексцитациони филтер има највећу ефикасност посматрања тамног поља.
③Карактеристике посматрања тамног поља УВ филтера ексцитације и осветљења концентратора тамног поља ексцитације БВ могу се сматрати између ове две методе осветљења, али прва има јача својства тамног поља и приказује светлије слике. Контраст је мали; овај други задржава својства светлосне путање тамног поља, па је приказана слика тамнија, а контраст је побољшан. Када се заправо користи флуоресцентни микроскоп, за посматрање треба користити метод осветљења који најбоље одговара захтевима узорка.
Мора се истаћи да чак и ако је УВ-побуђени кондензатор тамног поља са најбољим контрастом осветљен, део ултраљубичастог ексцитационог светла преломљеног или расејаног узорком ће ући у сочиво објектива. Аутофлуоресценција може погоршати одговор на слику. Због тога се филтер који апсорбује УВ мора да се користи испред окулара као филтер за одсецање.
