Захтеви за припрему узорака за флуоресцентну микроскопију
Захтеви за припрему узорка за флуоресцентну микроскопију
(1) Стаклени тобоган
Дебљина клизног стакла треба да буде између 0.8-Л2мм. Превише дебео тобоган ће апсорбовати више светлости с једне стране и не може фокусирати побудно светло на узорак с друге стране. Слајдови морају бити глатки, уједначене дебљине и без очигледне аутофлуоресценције. Понекад се користе кварцни слајдови.
(2) Поклопно стакло
Дебљина покривног стакла је око 0.17 мм, глатко. Да би се појачало ексцитационо светло, може се користити и интерферентно покривно стакло, које је специјално покривно стакло обложено са неколико слојева супстанци (као што је магнезијум флуорид) које имају различите ефекте интерференције на светлост различитих таласних дужина, што може учинити флуоресценција глатка. Побуђена светлост се пропушта, а побудна светлост се рефлектује, а ова рефлектована побудна светлост може побуђивати узорак.
(3) Примерак
Кришке ткива или други узорци не би требало да буду превише дебели. Ако је дебљина предебела, највећи део ексцитационе светлости ће бити утрошен у доњем делу узорка, док горњи део директно посматран сочивом објектива не може бити потпуно узбуђен. Поред тога, флуоресценција узрокована преклапањем ћелија или нечистоћама, позадинско неспецифично бојење утиче на процену.
(4) уље за огледало
Генерално, када се посматрају узорци са флуоресцентним микроскопима тамног поља и микроскопима за урањање у уље, мора се користити уље за потапање. Најбоље је користити специјално нефлуоресцентно уље за потапање. Уместо тога се може користити и глицерин, а може се користити и течни парафин, али је индекс преламања низак, што има благи утицај на квалитет слике.
Разумевање светлосне коцке флуоресцентне микроскопије
Флуоресценција је светлост којом електрони у супстанци апсорбују светлосну енергију из стања ниске енергије у стање високе енергије, а затим ослобађају светлост када се врати у стање ниске енергије. То је нетемпературна светлост - луминисценција. То јест: супстанца апсорбује краткоталасну светлост, улази у побуђено стање и емитује дуготаласну светлост.
Било да се ради о аутофлуоресценцији супстанце, флуоресцентној боји или флуоресцентном протеину израженом фузијом, она мора бити узбуђена специфичном таласном дужином светлости (ексцитација). Након што електрони мигрирају и изгубе енергију, емитују светлост одређене дуге таласне дужине (Емисија). , који се може прикупити системом за детекцију да би се постигла функција идентификације специфичне флуоресценције.
Шта је флуоресцентна светлосна коцка?
У посматрању и снимању флуоресцентним микроскопом, ексцитационо светло одређене таласне дужине и одговарајућа дуготаласна емисиона светлост обезбеђује флуоресцентна светлосна коцка, тако да се флуоресцентни сигнал може прикупити голим оком, екраном или камером. Стога, флуоресцентна светлосна коцка одређује шта се може детектовати. Кључни уређај флуоресцентног сигнала, његове карактеристике укључују ЕКС: параметре филтера таласне дужине побуде, ЕМ: параметре филтера таласне дужине емисије и ДМ: параметре дихотомног огледала. Узмите ДАПИ светлосну коцку Револве интегрисаног флуоресцентног микроскопа као пример, ЕКС: 385/30, ЕМ: 450/50, ДМ: 425.
The light emitted by the light source passes through DAPI EX to obtain excitation light in a specific wavelength range, that is, light of 385±15nm, which specifically excites fluorescent substances that can only be excited within this range; the DM dichroic mirror separates the excitation light from the fluorescence Optical elements, as special mirrors, reflect only specific wavelengths of light and allow all other wavelengths to pass through, so only >425нм светлост се може пренети на ЕМ; ЕМ емисиони филтери се користе за одвајање флуоресценције коју емитује флуорофор од осталих позадинских оптичких елемената за одвајање светлости. Емисиони филтери емитују светлост на таласној дужини флуоресценције кроз дихроично огледало док блокирају сву другу светлост која цури из извора побудног светла (рефлектује се од узорка или оптике). Емитована таласна дужина светлости је већа од ЕМ коју треба посматрати, односно само светлост у опсегу од 450±25нм улази у систем детекције. Одговарајући избор ЕКС, ЕМ филтера и ДМ дихотомија може помоћи истраживачима да постигну веће односе сигнал-шум (С/Н).
