Постоје многе предности двофотонске флуоресцентне микроскопије
1) Светлост дугих таласа је мање погођена расејањем од светлости кратког таласа и може лако продрети у узорак;
2) Флуоресцентни молекули изван фокалне равни нису побуђени, што омогућава да више ексцитационе светлости достигне фокалну раван, омогућавајући ексцитационој светлости да продре у дубље узорке;
3) Блиско инфрацрвено светло дугих таласа је мање токсично за ћелије од светлости кратког таласа;
4) Приликом посматрања узорака помоћу двофотонског микроскопа, фотоизбељивање и фототоксичност се јављају само у фокалној равни. Због тога су двофотонски микроскопи погоднији од једнофотонских микроскопа за посматрање дебелих узорака, за посматрање живих ћелија или за извођење експеримената фотобељења са фиксном тачком.
Познавање конфокалне флуоресцентне микроскопије
Основни принцип конфокалне флуоресцентне микроскопије: Користите тачкасти извор светлости да осветлите узорак да бисте формирали малу, добро дефинисану светлосну тачку на фокалној равни. Флуоресценција коју емитује тачка након што је осветљена сакупља се сочивом објектива и враћа се у дихроично огледало дуж првобитне путање светлости осветљења. чине разделник снопа. Спектрометар шаље флуоресценцију директно на детектор. Испред извора светлости и детектора налази се рупица, који се називају рупица за осветљење и рупица за детекцију, респективно. Геометријске димензије ова два су конзистентне, око 100-200нм; у односу на светлосну тачку на фокалној равни, ова два су коњугирана, то јест, светлосна тачка пролази кроз низ сочива и на крају може бити фокусирана на отвор за осветљење и отвор за детекцију у исто време. На овај начин, светлост из фокалне равни може бити концентрисана унутар отвора за детекцију, док је расејана светлост изнад или испод жижне равни блокирана изван отвора за детекцију и не може се снимити. Узорак се скенира тачку по тачку ласером, а фотомултипликаторска цев иза отвора за детекцију такође добија конфокалну слику одговарајуће светлосне тачке тачку по тачку, која се претвара у дигитални сигнал и преноси на рачунар, и на крају се агрегира на екрану у јасну конфокалну слику целе фокалне равни. .
Свака слика у фокалној равни је заправо оптички попречни пресек узорка. Овај оптички попречни пресек увек има одређену дебљину и назива се и оптички танак пресек. Пошто је интензитет светлости у фокусу много већи од интензитета светлости у нефокусу, а светлост у нефокалној равни је филтрирана рупицама, дубина поља конфокалног система је приближно нула. Скенирање дуж правца З-осе може да оствари оптичку томографију, формирајући жељени. Посматрајте дводимензионални оптички пресек на фокусираној тачки узорка. Комбиновањем скенирања у КСИ равни (фокална раван) са скенирањем по З-оси (оптичка оса), акумулацијом континуираних нивоа дводимензионалних слика и њиховом обрадом специјализованим компјутерским софтвером, може се добити тродимензионална слика узорка.
То јест, рупица за детекцију и рупица извора светлости су увек фокусирани на исту тачку, тако да флуоресценција побуђена изван равни фокуса не може ући у рупицу за детекцију.
Једноставан израз принципа рада ласерског конфокалног је да користи ласер као извор светлости. На основу традиционалног снимања флуоресцентног микроскопа, додају се уређај за ласерско скенирање и уређај за коњугатно фокусирање, а систем контролише компјутер за прикупљање и обраду дигиталних слика.
