Двофотонска флуоресцентна микроскопија има многе предности:
1) на дуже таласне дужине светлости мање утиче расејање него на краће таласне дужине светлости да продре у узорак;
(2) Флуоресцентни молекули изван фокалне равни нису побуђени тако да више ексцитационе светлости може да достигне фокалну раван, тако да ексцитационо светло може да продре дубље у узорак;
3) Дуже таласне дужине блиске инфрацрвене светлости су мање токсичне за ћелије од краћих таласних дужина;
4) Када се користи двофотонски микроскоп за посматрање узорка, фотобељење и фототоксичност су присутни само у фокалној равни. Због тога су двофотонски микроскопи погоднији од једнофотонских микроскопа за посматрање дебелих узорака, за посматрање живих ћелија или за спровођење експеримената фотобељења на тачки.
Познавање конфокалног флуоресцентног микроскопа
Основни принцип конфокалног флуоресцентног микроскопа: тачкасти извор светлости се користи за озрачивање узорка, формирајући малу, добро дефинисану тачку светлости на фокалној равни. Флуоресценција која се емитује из ове тачке након озрачивања сакупља се сочивом објектива и шаље назад у разделник снопа који се састоји од двосмерног хроматског огледала дуж оригиналне путање светлости зрачења. Разделник снопа шаље флуоресценцију директно на детектор. И извор светлости и детектор имају рупицу испред себе, која се назива рупица за осветљење и рупица за детекцију, респективно. Обе имају исту геометрију, око 100-200 нм, и коњугиране су у односу на тачку светлости на жижној равни, тј. светлосна тачка пролази кроз низ сочива и на крају се може фокусирати на оба светлећа и рупице детектора. На овај начин, светлост из фокалне равни може конвергирати унутар отвора сонде, док је расејана светлост изнад или испод фокалне равни блокирана изван отвора сонде и не може се снимити. Ласер скенира узорак тачку по тачку, а фотомултипликаторска цев након детекције рупице такође добија конфокалну слику одговарајуће светлосне тачке тачку по тачку, која се претвара у дигитални сигнал и преноси на рачунар и коначно конвергира у јасну конфокална слика целе фокалне равни на екрану.
Свака слика у фокалној равни је заправо оптички попречни пресек узорка, а овај оптички пресек увек има одређену дебљину, познату и као оптички лист. Пошто је интензитет светлости у жижној тачки много већи од оног у нефокалној тачки, а светлост у нефокалној равни филтрира рупица, дубина поља конфокалног система је приближна нули, а скенирање дуж правца З-осе омогућава оптичкој томографији да формира дводимензионални оптички пресек узорка који се посматра на жаришту. Комбиновањем скенирања у равни КСИ (фокална раван) са скенирањем по З-оси (оптичка оса), тродимензионална слика узорка се може добити акумулацијом узастопних слојева дводимензионалних слика, које се обрађују специјализованим рачунарским софтвером.
То значи да су рупица за детекцију и рупица извора светлости увек фокусирана на истој тачки, тако да флуоресценција побуђена изван фокалне равни не може да уђе у рупицу за детекцију.
Принцип рада ласерског конфокалног једноставно се изражава да користи ласер као извор светлости, на основу традиционалног флуоресцентног микроскопског снимања, додатног уређаја за ласерско скенирање и коњугованог уређаја за фокусирање, путем компјутерске контроле за спровођење дигиталног система за аквизицију и обраду слике.
