Разумевање конфокалне флуоресцентне микроскопије
Основни принцип конфокалне флуоресцентне микроскопије: Користите тачкасти извор светлости да осветлите узорак да бисте формирали малу, добро дефинисану светлосну тачку на фокалној равни. Флуоресценција коју емитује тачка након што је осветљена сакупља се сочивом објектива и враћа се у дихроично огледало дуж првобитне путање светлости осветљења. чине разделник снопа. Спектрометар шаље флуоресценцију директно на детектор. Испред извора светлости и детектора налази се рупица, који се називају рупица за осветљење и рупица за детекцију, респективно. Геометријске димензије ова два су конзистентне, око 100-200нм; у односу на светлосну тачку на фокалној равни, ова два су коњугирана, то јест, светлосна тачка пролази кроз низ сочива и на крају може бити фокусирана на отвор за осветљење и отвор за детекцију у исто време. На овај начин, светлост из фокалне равни се може концентрисати у домету отвора за детекцију, док је расејана светлост одозго или испод жижне равни блокирана изван отвора за детекцију и не може се снимити. Узорак се скенира тачку по тачку ласером, а фотомултипликаторска цев иза рупице за детекцију такође добија конфокалну слику одговарајуће светлосне тачке тачку по тачку, која се претвара у дигитални сигнал и преноси на рачунар, и коначно агрегира на екран у јасну конфокалну слику целе фокалне равни. .
Свака слика у фокалној равни је заправо оптички попречни пресек узорка. Овај оптички попречни пресек увек има одређену дебљину и назива се и оптички танак пресек. Пошто је интензитет светлости у фокусу много већи од интензитета светлости у нефокусу, а светлост у нефокалној равни је филтрирана рупицама, дубина поља конфокалног система је приближно нула. Скенирање дуж правца З-осе може да оствари оптичку томографију, формирајући жељени. Посматрајте дводимензионални оптички пресек на фокусираној тачки узорка. Комбиновањем скенирања у КСИ равни (фокална раван) са скенирањем по З-оси (оптичка оса), акумулацијом континуираних нивоа дводимензионалних слика и њиховом обрадом специјализованим компјутерским софтвером, може се добити тродимензионална слика узорка.
То јест, рупица за детекцију и рупица извора светлости су увек фокусирани на исту тачку, тако да флуоресценција побуђена изван равни фокуса не може ући у рупицу за детекцију.
Једноставан израз принципа рада ласерског конфокалног је да користи ласер као извор светлости. На основу традиционалног снимања флуоресцентног микроскопа, додају се уређај за ласерско скенирање и уређај за коњугатно фокусирање, а систем контролише компјутер за прикупљање и обраду дигиталних слика.
