Зашто треба да користим конфокални микроскоп?
1. Оптички микроскоп је усавршен трудом и побољшањима наших великих претходника. У ствари, уобичајени микроскоп нам може лако и брзо пружити прелепе микроскопске слике. Међутим, догађај који је направио револуцију у свету скоро савршених микроскопа био је проналазак „конфокалног микроскопа за ласерско скенирање“. Овај нови тип микроскопа карактерише оптички систем који извлачи информације о слици само са површине на којој је концентрисан фокус, а променом фокуса уз враћање добијених информација у меморију слике, могуће је добити оштру слику са пуне 3-информације о димензијама. На овај начин је могуће лако добити информације о облику површине које се не могу потврдити конвенционалним микроскопом. Поред тога, док су „повећање резолуције“ и „продубљивање дубине фокуса“ конфликтни услови за конвенционалне оптичке микроскопе, посебно при великом увећању, овај проблем се решава помоћу конфокалних микроскопа.
2. Предности конфокалног оптичког система
Шематски дијаграм ласерског конфокалног микроскопа
Конфокални оптички систем је тачкасто осветљење узорка, док се рефлектована светлост такође прима помоћу тачкастог рецептора. Када се узорак постави у фокусну тачку, скоро сва рефлектована светлост стиже до фоторецептора, а када је узорак ван фокуса, рефлектована светлост не може доћи до фоторецептора. Другим речима, у конфокалном оптичком систему, емитује се само слика која се поклапа са жаришном тачком, а мрље и бескорисно расејано светло су блокирани.
3. Зашто користити ласер?
У конфокалном оптичком систему, узорак се осветљава у тачки, а рефлектовану светлост прима сензор тачке. Због тога је неопходан тачкасти извор светлости. Ласери су у великој мери тачкасти извор светлости. У већини случајева, извор светлости за конфокалне микроскопе је ласерски извор светлости. Поред тога, монохроматичност, усмереност и одличан облик зрака ласера су важни разлози за њихово широко усвајање.
4. Могуће је посматрање у реалном времену засновано на скенирању велике брзине.
За ласерско скенирање, акустични оптички дефлектор (Ацоустиц Оптицал Дефлецтор, АО приме) се користи у хоризонталном правцу, а серво-електронски контролисано огледало за скенирање зрака (Серво Галвано-миррор) се користи у вертикалном правцу. Пошто у АО дефлектору нема механичких вибрација, могуће је скенирање великом брзином, а могуће је и посматрање на екрану монитора у реалном времену. Велика брзина ове камере је веома важна ставка која директно утиче на брзину фокуса и проналажење позиције.
5. Однос између положаја фокуса и осветљености
У конфокалном оптичком систему, узорак је правилно постављен у фокусни положај када је осветљеност зуи велика, испред и иза њега, његова светлост ће бити нагло смањена (слика 4 пуна линија). Ова осетљива селективност фокалне равни је принцип који стоји иза висинске оријентације конфокалног микроскопа и дубине ширења фокуса. Насупрот томе, уобичајени оптички микроскопи не показују никакву значајну промену у осветљености пре и после фокусног положаја (испрекидана линија на слици 4).
6. Висок контраст, висока резолуција
У конвенционалном оптичком микроскопу, рефлектована светлост од дела микроскопа ван фокуса омета и преклапа се са фокусним делом микроскопа, што доводи до смањења контраста слике. Насупрот томе, у конфокалном оптичком систему, расејана светлост изван фокусне тачке и унутар сочива објектива је скоро потпуно уклоњена, што резултира сликама са веома високим контрастом. Поред тога, моћ раздвајања микроскопа је побољшана јер светлост двапут пролази кроз сочиво објектива, изоштравајући слику тачке.
7. Функција оптичке локализације
У конфокалном оптичком систему, рефлектована светлост је заштићена микро-отвором у тачки која није фокусна тачка. Као резултат тога, када се посматра тродимензионални узорак, слика се формира као да је узорак исечен са жаришном тачком (слика 5). Овај ефекат се назива оптичка локализација и једна је од карактеристика конфокалних оптичких система.
