Одређивање броја микроорганизама - метода директног бројања микроскопа!
Раст популације бактерија се манифестује повећањем броја ћелија или повећањем ћелијске масе. Методе за одређивање броја ћелија укључују методу директног бројања микроскопом, методу бројања колонија на плочи, методу односа фотоелектричног уља, методу максималне вероватноће и методу мембранске филтрације. Методе мерења ћелијске материје обухватају одређивање суве тежине ћелије, одређивање одређених ћелијских компоненти као што су садржај азота, РНК и ДНК и одређивање метаболита. Укратко, постоји много метода за мерење раста микроорганизама, од којих свака има своје предности и мане, и треба их одабрати у складу са специфичном ситуацијом. Овај експеримент углавном уводи микроскопску методу директног бројања која се обично користи у производњи и научним истраживањима.
1. Сврха Захтеви
1. Разјаснити принцип броја крвних зрнаца.
2. Овладати методом бројања микроорганизама помоћу бројача крвних зрнаца.
2. Основни принципи
Метода директног бројања микроскопом је једноставна, брза и интуитивна метода за директно пребројавање мале количине суспензије узорка који се тестира на посебном стакленом предмету са одређеном површином и запремином (такође познат као бројач бактерија). Методе. Тренутно, најчешће коришћени бројачи бактерија у земљи и иностранству су: табла за бројање крвних зрнаца, бројач бактерија Петерофф-Хаусер и бројач бактерија Хавкслеи, итд. Могу се користити за бројање квасца, бактерија, спора плесни и других суспензија, и основни принцип је исти. Последња два типа бројача бактерија имају укупну запремину од 0.02мм3 након што су покривени покривним стаклом, а растојање између покровног стакла и клизача је само 0,02мм, тако да уље имерзионо сочиво објектива може се користити за посматрање и посматрање малих ћелија као што су бактерије. цоунт. Поред ових бактериометара, постоји и метода процене односа површине размаза према површини видног поља посматраног директно под микроскопом, која се углавном користи за бактериолошко испитивање млека. Предности методе директног бројања микроскопом су интуитивне, брзе и једноставне за руковање. Међутим, недостатак ове методе је што је измерени резултат обично збир мртвих и живих ћелија. Тренутно постоје неке методе за превазилажење овог недостатка, као што је комбинација културе микрокомора за бојење живих бактерија (кратко време) и додавање инхибитора ћелијске деобе да би се постигла сврха бројања само живих бактерија.
У овом експерименту, хемоцитометар је коришћен као пример за директно микроскопско бројање. За употребу друга два типа бројача бактерија, погледајте упутства сваког произвођача. Бројање директно под микроскопом помоћу хемоцитометра је уобичајена метода за бројање микроорганизама. Плоча за бројање је посебан стаклени тобоган, на коме су три платформе формиране са четири прореза; шира платформа у средини је кратким попречним прорезом подељена на две половине, а са сваке стране платформе је мрежа. Свака мрежа је подељена на девет великих квадрата, а велики квадрат у средини је соба за бројање. Структура плоче за бројање крвних зрнаца приказана је на слици л{{{{10}}}}. Скала собе за бројање генерално има две спецификације, једна је велики квадрат подељен на 25 средњих квадрата, а сваки средњи квадрат је подељен на 16 малих квадрата (слика 15-2); други је велики трг. Квадрат је подељен на 16 средњих квадрата, а сваки средњи квадрат је подељен на 25 малих квадрата, али без обзира каква је табла за бројање, у сваком великом квадрату има 400 малих квадрата. Дужина странице сваког великог квадрата је 1 мм, а површина сваког великог квадрата је 1 мм2. Након прекривања покривним стаклом, висина између покровног стакла и клизног стакла је 0,1мм, тако да је запремина коморе за бројање 0,лмм3 (хиљадити део милилитра). Слика 15-1 Структура плоче за бројање крвних зрнаца (1) Слика 15-2 Структура плоче за бројање крвних зрнаца (2) А. Поглед спреда; Б. Поглед на уздужни пресек; Увећана мрежа, велики квадрат у средини је комора за бројање 1. Крвне ћелије Плоча за бројање; 2. Поклопно стакло; 3. Када бројите у комори за бројање, обично пребројите укупан број бактерија у пет квадрата, затим израчунајте просек сваког квадрата и помножите са 25 или 16 да бисте добили Укупан број бактерија у великом квадрату се затим претвара у укупан број бактерија у 1мл бактеријског раствора. Нека укупан број бактерија у пет квадрата буде А, а однос разблажења бактеријског раствора Б. Ако је то плоча за бројање са 25 квадрата, укупан број бактерија у 1 мЛ бактеријског раствора {{26} } А/5×25×104× Б=50000А·Б(комади) Слично, ако је плоча за бројање са 16 средњих квадрата, укупан број бактерија у 1мЛ бактеријског раствора=А/ 5×16×104×Б=32000А·Б (комада)
3. Опрема
1. Бактерије
Саццхаромицес церевисиае
2. Инструменти или други прибор
Хемоцитометар, микроскоп, покровно стакло, стерилна капиларна капаљка.
4. Оперативни кораци
1. Припрема бактеријске суспензије
Саццхаромицес церевисиае је припремљена у бактеријску суспензију одговарајуће концентрације са стерилним физиолошким раствором.
2. Просторија за бројање микроскопа
Пре додавања узорака, микроскопски прегледајте комору за бројање плоче за бројање. Ако има прљавштине, потребно је очистити и осушити пре бројања.
3. Додајте узорак
Покријте чист и сув хемоцитометар покровним стакалцем, а затим стерилном капиларном капаљком испустите малу кап промућкане суспензије Саццхаромицес церевисиае са ивице покровног стакла и пустите да се раствор бактерије аутоматски креће дуж процепа капиларном осмозом. Уласком у собу за бројање, општа соба за бројање може се напунити бактеријском течношћу. Приликом узорковања, прво протресите раствор бактерија; приликом додавања узорака, у комори за бројање не би требало да се стварају мехурићи ваздуха.
4. Бројање микроскопом
Након додавања узорка, останите мирно 5 минута, а затим поставите хемоцитометар на подијум микроскопа, прво пронађите локацију коморе за бројање помоћу микроскопа мале снаге, а затим пређите на микроскоп велике снаге за бројање. Подесите интензитет светлости микроскопа на одговарајући начин. За микроскопе који користе огледала за осветљење, пазите да не одступате од једне стране светла, иначе неће бити лако да се у видном пољу јасно виде квадратне линије собе за бројање, или ће се само вертикалне или хоризонталне линије. да се види. Ако се утврди да је бактеријски раствор превише концентрован или превише разблажен пре бројања, потребно је поново подесити разблаживање пре бројања. Генерално, за разблаживање узорка је потребно око 5 до 10 бактерија у свакој малој ћелији. Свака комора за бројање бира 5 средњих ћелија (опционо 4 угла и једна средња ћелија у центру) за бројање. Ћелије које се налазе на линији мреже се обично броје само на горњој и десној линији. У случају пупања квасца, када величина пупољка достигне половину матичне ћелије, рачуна се као две бактеријске ћелије. Да бисте пребројали узорак, израчунајте садржај бактерија у узорку тако што ћете израчунати просечну вредност из две коморе за бројање.
5. Оперите број крвних зрнаца
Након употребе, исперите плочу за бројање крвних зрнаца водом из славине, немојте је трљати тврдим предметима, а након прања је осушите сами или феном. Микроскопски преглед да би се видело да ли у свакој малој ћелији постоје заостале бактерије или други седименти. Ако није чист, мора се више пута прати док не буде чист.
