Примена флуоресцентне микроскопије са тоталном унутрашњом рефлексијом
ТИРФМ (Тотал Интернал Рефлецтион Флуоресценце Мицросцопе), флуоресцентни микроскоп са тоталном унутрашњом рефлексијом, када светлост уђе у медијум са нижим индексом преламања из средине са високим индексом преламања, ако је упадни угао довољно велики, сва светлост се рефлектује без преламања, али у Интерфејс два медија производи пролазне таласе који могу побудити флуоресценцију унутар 100 нм у близини интерфејса да би се остварило посматрање површине објекта. Побуђена светлост се може послати кроз осветљивач конвенционалног флуоресцентног микроскопа или специјалног осветљивача, а угао упада ласера се може контролисати. Метода тренутне ексцитације поља се користи да спречи ексцитационо светло да уђе у детектор. Побуђујућа светлост на интерфејсу између стакла и воде производи пуну унутрашњу слику која се остварује рефлексијом. Због експоненцијалног слабљења ексцитационог светла, само површина узорка веома близу укупне површине рефлексије ће произвести рефлексију флуоресценције, што у великој мери смањује интерференцију буке позадинског светла на циљ посматрања, тако да се ова технологија широко користи у динамичком посматрању супстанци ћелијске површине.
Шематски дијаграм флуоресцентне микроскопије тоталне унутрашње рефлексије (ТИРФМ)
①Узорак ②Еванесцентни таласни опсег ③Поклопно стакло ④Потапање у уље ⑤Циља ⑥Емисиони сноп (сигнал) ⑦Побудни сноп
Да би се постигла потпуна унутрашња рефлексија, потребан је велики упадни угао, на пример, упадни угао на интерфејсу стакло-вода је већи од 61 степен. Ово се може постићи помоћу призме, која се назива ТИРФМ заснован на призми, или објективним сочивом са великим нумеричким отвором, који се назива ТИРФМ типа објектива. Тренутни комерцијализовани флуоресцентни микроскопи са тоталном унутрашњом рефлексијом су генерално типа сочива објектива, велике брзине и високе прецизности.
Флуоресцентна микроскопија са тоталном унутрашњом рефлексијом се широко користи у неким биолошким пољима јер може да реализује посматрање флуоресценције у веома танком опсегу (мање од 100 нм) на површини објеката. Као што су следеће апликације:
Посматрање слика површине ћелије: површинска структура ћелијске мембране, контакт површине ћелије, динамика површине мембране/локација протеина.
Посматрање и манипулација са једним молекулом: миозин, актин и Ци{1}}обележени АТП.
Покрет површине ћелијске мембране: као што је гутање везикула, издисање везикула и егзокрина везикула. тхе
Посматрање феномена варничења калцијума у ћелијској мембрани, праћење јонских канала.
Истраживање молекуларних мотора: ротациони мотори, протеини цитоскелета, полимери, Г протеини, прстенасти протеини, нуклеотидни мотори.
Осим у области биологије, има добре примене и у области хемије за посматрање хемијских молекуларних структура.
