Класификација и рад микроскопа за истраживање ћелија
Микроскоп је примарни алат за посматрање ћелија. Према различитим изворима светлости, може се поделити у две категорије: оптички микроскопи и електронски микроскопи. Први користи видљиву светлост (УВ микроскопи користе ултраљубичасто светло) као извор светлости, док други користи електронске зраке као извор светлости.
-,Оптички микроскоп
(1) Обичан оптички микроскоп
Обични биолошки микроскопи се састоје од три дела, и то: ① система осветљења, укључујући извор светлости и кондензатор; ② систем оптичког увећања, састављен од објектива и окулара, који је главно тело микроскопа. Да би се елиминисала сферна аберација и хроматска аберација, и окулар и објектив ③Механички уређај, који се користи за фиксирање материјала и олакшавање посматрања (слика 2-1).
Да ли је слика микроскопа јасна не одређује се само увећањем, већ се односи и на резолуцију микроскопа. Резолуција се односи на способност микроскопа (или људског ока да буде удаљено 25 цм од мете) да разликује најмању удаљеност између објеката. Величина резолуције је одређена Таласна дужина и однос отвора светлости и индекс преламања медија изражени су формулом:
У формули: н=индекс преламања средине;=угао отвора бленде (угао отварања узорка према отвору сочива објектива), НА=отвор бленде (нумерички отвор бленде). Угао сочива је увек мањи од 180 степени, тако да максимална вредност сина/2 мора бити мања од 1.
Индекс преламања стакла који се користи за прављење оптичког сочива је 1,65 до 1,78, а индекс преламања коришћеног медијума је ближи стаклу, то боље. За сува сочива објектива, медијум је ваздух, а однос бленде сочива је генерално 0.05 до 0,95; за уљна сочива, кедрово уље се користи као медиј, а однос бленде сочива може бити близу 1,5.
Таласна дужина обичне светлости је {{0}}}нм, тако да вредност резолуције микроскопа неће бити мања од 0.2μм, а резолуција људског ока је 0,2мм, тако да максимално увећање општег дизајна микроскопа је обично 1000Кс.
(2) Флуоресцентна микроскопија
Неке супстанце у ћелијама, као што је хлорофил, могу да флуоресцирају након зрачења ултраљубичастим зрацима; неке супстанце саме по себи не могу да флуоресцирају, али ако су обојене флуоресцентним бојама или флуоресцентним антителима, могу да флуоресцирају и када су зрачене ултраљубичастим зрацима, а флуоресцентни микроскоп (сл. 2-2, 3, 4) је један од алата за квалитативна и квантитативна истраживања таквих супстанци.
Флуоресцентни микроскопи и обични микроскопи имају следеће разлике:
1. Метода осветљења је обично епи-осветљење, односно извор светлости се пројектује на узорак кроз сочиво објектива (слика 2-3);
2. Извор светлости је ултраљубичасто светло, таласна дужина је краћа, а резолуција је већа од оне код обичних микроскопа;
3. Постоје два специјална филтера, онај испред извора светлости се користи за филтрирање видљиве светлости, а онај између окулара и сочива објектива се користи за филтрирање ултраљубичастог светла ради заштите очију.
(3) Конфокални микроскоп за ласерско скенирање
Ласерски конфокални микроскоп за скенирање (ласерски конфокални микроскоп за скенирање, слика 2-5, 6) користи ласер као извор светлости за скенирање и скенира слику тачку по тачку, линију по линију, површину по површину, а колекција ласера за скенирање и флуоресценције дели сочива објектива, а фокус сочива објектива је Фокална тачка ласера за скенирање је такође тачка објекта тренутног снимања. Пошто је таласна дужина ласерског зрака кратка, а сноп веома танак, конфокални ласерски микроскоп за скенирање има вишу резолуцију, која је око 3 пута већа од обичног оптичког микроскопа. Систем је фокусиран једном и скенирање је ограничено на једну раван узорка. Када је дубина фокусирања различита, могу се добити слике различитих нивоа дубине узорка. Ове информације о слици се чувају у рачунару. Путем компјутерске анализе и симулације може се приказати тродимензионална структура узорка ћелије.
Конфокална ласерска скенирајућа микроскопија се може користити не само за посматрање морфологије ћелије, већ и за квантитативну анализу интрацелуларних биохемијских компоненти, статистику оптичке густине и мерење морфологије ћелије.
(4) Микроскоп тамног поља
Микроскоп тамног поља (микроскоп тамног поља, слика 2-7) има светлосни лист у центру кондензатора, тако да светло осветљења не улази директно у људско сочиво, већ само светлост коју рефлектује и дифракује узорак дозвољено је да уђе у сочиво објектива, тако да је позадина видног поља црна, ивице објеката су светле. Користећи овај микроскоп, честице мале величине од 4-200нм се могу видети, а резолуција може бити 50 пута већа од оне код обичних микроскопа.
(5) Фазни контрастни микроскоп
Фазоконтрастни микроскоп (фазоконтрастни микроскоп, слика 2-8, 9) П. Зерникеа је изумљен 1932. године и за њега је добио Нобелову награду за физику 1953. године. Највећа карактеристика овог микроскопа је да може да посматра необојене узорке и живе ћелије.
Основни принцип фазноконтрастне микроскопије је да промени оптичку разлику путање видљиве светлости која пролази кроз узорак у разлику амплитуде, чиме се побољшава контраст између различитих структура и чине различите структуре јасно видљивим. Након проласка кроз узорак, светлост се ломи, одступа од првобитне оптичке путање и касни за 1/4λ (таласна дужина). Ојачајте, повећајте или смањите амплитуду, повећајте контраст. У погледу структуре, фазни контрастни микроскопи имају две посебне карактеристике које се разликују од обичних оптичких микроскопа:
1. Прстенаста дијафрагма се налази између извора светлости и кондензатора, а њена функција је да учини да светлост која пролази кроз кондензатор формира шупљи светлосни конус и фокусира се на узорак.
2. Фазна плоча (прстенаста фазна плоча) додаје фазну плочу обложену магнезијум флуоридом у сочиво објектива, што може одложити фазу директне или дифрактиране светлости за 1/4λ. Постоје две врсте:
①А плус фазна плоча: Директно светло је одложено за 1/4λ. Након што су две групе светлосних таласа комбиноване, светлосни таласи се сабирају, а амплитуда се повећава. Структура узорка је светлија од околног медијума, формирајући светао контраст (или негативан контраст).
② Б плус фазна плоча: Дифрактована светлост касни за 1/4λ. Након што се два сета зрака комбинују, светлосни таласи се одузимају, а амплитуда постаје мања, формирајући тамни контраст (или позитиван контраст), а структура је тамнија од околног медија.
