Поређење и карактеристике флуоресцентних микроскопа и конвенционалних оптичких микроскопа
Флуоресцентни микроскоп се разликује од обичног оптичког микроскопа. Уместо да посматра узорке под осветљењем из конвенционалног извора светлости, он користи светлост одређене таласне дужине (обично ултраљубичасто или плаво-љубичасто светло) да побуђује флуоресцентне супстанце унутар узорка, узрокујући да емитују флуоресценцију. Дакле, извор светлости флуоресцентног микроскопа не служи за директно осветљење; делује као извор енергије за побуђивање ендогених флуоресцентних супстанци у узорку. Ми смо у могућности да посматрамо узорак не због осветљења из извора, већ због флуоресценције коју емитују флуоресцентне супстанце у узорку након апсорпције ексцитационе светлости.
Из тога следи да је кључна карактеристика флуоресцентног микроскопа његов извор светлости, који може да обезбеди обилно ексцитационо светло унутар одређеног опсега таласних дужина да би се обезбедио довољан интензитет ексцитације за флуоресцентне супстанце у узорку за испитивање. У међувремену, флуоресцентни микроскоп мора бити опремљен одговарајућим системом филтера. Као основно средство за хистохемију флуоресценције, углавном се састоји од извора светлости ултра високог притиска, комплета филтера (укључујући филтере за побуђивање и филтере за баријеру), оптичког система и фотографског система. Делује тако што узорке побуђује светлошћу одређене таласне дужине да би се произвела флуоресценција.
Методе побуђивања флуоресценције: Класификоване према опсегу таласних дужина на УВ ексцитацију (метода ултраљубичастог осветљења) и БВ ексцитацију (метода плаво-љубичастог светла). УВ ексцитација користи скоро ултраљубичасто светло краће од 400 нм за побуду. Није укључена видљива ексцитациона светлост, тако да посматрана флуоресценција показује инхерентну флуоресценцију боје. Ово олакшава разликовање специфичне флуоресценције на узорку од аутофлуоресценције позадинског ткива.
БВ метода ексцитације: Ексцитација се изводи светлошћу у распону од ултраљубичастог до плавог светла, са центром на 404 нм и 434 нм. Пошто плава светлост зрачи узорак у овој методи, гранични филтер система за посматрање флуоресценције мора у потпуности да блокира плаво светло док у потпуности преноси потребну зелену и жуту флуоресценцију. Ова метода се примењује на флуорохроме који се користе у техникама флуоресцентних антитела. Максимална таласна дужина апсорпције ексцитационе светлости и максимална таласна дужина емисије флуоресценције су релативно близу, тако да су филтери са оштрим резом потребни за БВ побуду. Плаво светло се овде користи као ексцитационо светло, што доноси високу ефикасност апсорпције флуорохрома и даје светлије слике. Његов недостатак је што се флуоресценција испод 500 нм не може детектовати, а сигнали изнад 500 нм дају целој слици жуту нијансу. У тестовима флуоресцентних антитела, специфичност се углавном оцењује према карактеристичној боји флуорохрома. Стога, када се процењује суптилна специфичност, горе наведени недостатак методе БВ ексцитације може имати значајан утицај.
