Поређење конфокалног микроскопа и обичног оптичког микроскопа
Општи оптички микроскоп
Општи биолошки микроскоп се састоји од три дела, и то: ① система осветљења, укључујући извор светлости и кондензатор; ② Систем оптичког појачања, који се састоји од објектива и окулара, је главно тело микроскопа. Да би се елиминисала сферна аберација и хроматска аберација, и окулар и сочиво објектива се састоје од сложених група сочива; (3) механички уређај, који се користи за фиксирање материјала и погодно посматрање.
Да ли је слика микроскопа јасна или не зависи не само од увећања, већ и од резолуције микроскопа. Резолуција се односи на способност микроскопа (или места где су људске очи удаљене 25 цм од мете) да разликује мали интервал објекта зуи. Резолуција зависи од таласне дужине светлости, односа отвора бленде и индекса преламања медија, који се изражава формулом:
Р=0.61λ /Н．А. Н．А．＝ｎсин /2
Где: н= индекс преламања средине;=угао огледала (угао отварања узорка према отвору сочива) и НА= нумерички отвор. Угао огледала је увек мањи од 180? Према томе, зуи вредност сина/2 мора бити мања од 1.
Индекс преламања стакла који се користи за прављење оптичких сочива је 1,65~1,78, а индекс преламања коришћеног медијума је ближи индексу стакла, то боље. За суво сочиво објектива, медијум је ваздух, а однос отвора бленде је генерално 0.05 ~ 0,95; Уљно сочиво користи мирисни асфалт као медијум, а брзина отварања сочива може бити близу 1,5.
Таласна дужина обичне светлости је 400~700нм, тако да резолуција микроскопа није мања од 0,2μм, а резолуција људског ока је 0,2мм, тако да је велико увећање зуи дизајнирано од стране општи микроскоп је обично 1000Кс к.
Зашто вам је потребан конфокални микроскоп?
1. Оптички микроскоп је усавршен трудом и усавршавањем наших великих претходника. У ствари, обични микроскопи нам могу пружити прелепе микроскопске слике једноставно и брзо. Међутим, десио се догађај који је донео револуционарну иновацију у овај скоро савршен свет микроскопа, а то је проналазак „конфокалног микроскопа за ласерско скенирање“. Овај нови микроскоп карактерише усвајање оптичког система који само издваја информације о слици на равни где је фокус концентрисан и враћање добијених информација у меморију слике уз промену фокуса, тако да се добија живописна слика са потпуним тродимензионалним информацијама. може се добити. Овом методом се једноставно могу добити информације о облику површине које се не могу потврдити обичним микроскопима. Поред тога, за обичне оптичке микроскопе, „побољшање резолуције“ и „продубљивање дубине фокуса“ су контрадикторни услови, посебно при великом увећању, али за конфокалне микроскопе овај проблем је решен.
2. Предности конфокалног оптичког система
Конфокални оптички систем осветљава тачку узорка, а рефлектовану светлост такође примају тачкасти рецептори. Када се узорак постави у фокусну позицију, скоро сва рефлектована светлост може да стигне до фоторецептора, али када узорак одступи од фокуса, рефлектована светлост не може да стигне до фоторецептора. То значи да ће у конфокалном оптичком систему бити приказана само слика која се поклапа са фокусом, а факула и бескорисно расејано светло ће бити заштићени.
3. Зашто користити ласер?
У конфокалном оптичком систему, узорак је осветљен, а рефлектовану светлост такође прима тачкасти фоторецептор. Стога, тачкасти извор светлости постаје неопходан. Ласер припада веома тачкастим изворима светлости. У већини случајева, извор светлости конфокалног микроскопа усваја ласерски извор светлости. Поред тога, карактеристике ласера, као што су монохроматичност, усмереност и одличан облик зрака, такође су важни разлози за његову широку употребу.
4. Посматрање у реалном времену засновано на скенирању велике брзине постаје могуће.
У ласерском скенирању, акустични оптички дефлектор (АО примарни елемент) се користи у хоризонталном правцу, а Серво Галвано-огледало се користи у вертикалном правцу. Пошто у јединици акустичног оптичког скретања нема механичког вибрационог дела, он може скенирати великом брзином и могуће је посматрати у реалном времену на екрану за праћење. Велика брзина ове камере је веома важан пројекат који директно утиче на брзину фокусирања и проналажења позиције.
5. Однос између положаја фокуса и осветљености
У конфокалном оптичком систему, када је узорак правилно постављен у фокусну позицију, осветљеност је велика, а пре и после њега, његова светлост ће нагло пасти (пуна линија на слици 4). Ова осетљива селективност фокалне равни је такође принцип мерења правца висине конфокалног микроскопа и проширења дубине жаришта. Насупрот томе, обичан оптички микроскоп нема очигледну промену светлине пре и после позиције фокуса (испрекидана линија на слици 4).
6. Висок контраст и висока резолуција
У општем оптичком микроскопу, рефлектована светлост која одступа од фокуса ће ометати и преклапаће се са делом за снимање фокуса, чиме се смањује контраст слике. Насупрот томе, у конфокалном оптичком систему, расејана светлост изван фокуса и расејана светлост унутар сочива објектива су скоро потпуно уклоњени, тако да се може добити слика са веома високим контрастом. Поред тога, пошто светлост два пута пролази кроз сочиво објектива, прво се изоштрава слика тачке, а такође се побољшава и резолуција микроскопа.
7. Функција оптичке локализације
У конфокалном оптичком систему, рефлектована светлост дела који није фокусна тачка је заштићена микропорама. Стога, када се посматра тродимензионални узорак, формира се слика попут оне која је настала након пресецања узорка фокусом (слика 5). Овај ефекат се назива оптичка локализација, што припада једној од специјалности конфокалног оптичког система.
8. Фокусирајте покретну функцију меморије
Такозвана рефлектована светлост изван фокуса је заштићена микропорама. С друге стране, може се сматрати да се све тачке на слици коју формира конфокални оптички систем поклапају са фокусом. Стога, ако се тродимензионални узорак помери дуж З-осе (оптичке осе), слика ће се акумулирати и ускладиштити у меморији, а зуи ће на крају добити слику формирану подударношћу целог узорка и фокуса. . На овај начин, функција бесконачне дубине фокуса назива се мобилна меморијска функција.
9. Функција мерења облика површине
У функцији померања фокуса, облик површине узорка се може мерити на бесконтактни начин додавањем петље за снимање висине. На основу ове функције могуће је снимити координате З-осе формиране великом вредношћу светлине зуи у сваком пикселу и на основу ове информације могу се добити информације везане за облик површине узорка.
10. Функција мерења високе прецизности микро величине
Јединица за пријем светлости усваја једнодимензионални ЦЦД сензор слике, тако да на њега не може утицати нагиб скенирања уређаја за скенирање, тако да се мерење високе прецизности може завршити. Поред тога, пошто је функција меморије померања фокуса са подесивом дубином фокуса усвојена у исто време, грешка мерења узрокована померањем фокуса може бити елиминисана.
11. Анализа тродимензионалне слике
Коришћењем функције мерења облика површине, тродимензионална слика површине узорка може се лако направити. Не само то, већ се могу спровести и многе врсте анализа, као што су: мерење храпавости површине, површина, запремина, површина, кружност, радијус, дужина зуи, периметар, центар гравитације, томографска слика, ФФТ трансформација, линија мерење ширине и тако даље.
Ласерски конфокални скенирајући микроскоп може се користити не само за посматрање морфологије ћелије, већ и за квантитативну анализу биохемијских компоненти у ћелијама, статистику оптичке густине и мерење морфологије ћелије.
