Разлике између флуоресцентних микроскопа и обичних светлосних микроскопа
Флуоресцентни микроскопи се разликују од конвенционалних оптичких микроскопа. Уместо да посматрају узорке светлошћу из обичног извора светлости, они користе светлост одређене таласне дужине (обично ултраљубичасто или плаво-љубичасто светло) да побуђују флуоресцентне супстанце унутар узорка на стакалцу микроскопа, узрокујући да ове супстанце емитују флуоресценцију. Стога, извор светлости флуоресцентног микроскопа не осветљава директно узорак; делује као извор енергије за побуђивање ендогених флуоресцентних супстанци у узорку. Узорак можемо видети не због осветљења из самог извора светлости, већ зато што флуоресцентне супстанце унутар узорка апсорбују енергију ексцитације и затим емитују флуоресценцију.
Из тога следи да је кључна карактеристика флуоресцентног микроскопа то што његов извор светлости може да обезбеди ексцитационо светло одређене таласне дужине, омогућавајући флуоресцентним супстанцама у прегледаном узорку да емитују флуоресценцију довољног интензитета. У међувремену, флуоресцентни микроскоп мора бити опремљен одговарајућим системом филтера. То је суштински инструмент за флуоресцентну хистохемију. Флуоресцентни микроскоп се углавном састоји од извора светлости ултра високог притиска, система филтера (укључујући ексцитационе филтере и филтере баријере), оптичког система и фотографског система. Делује тако што користи светлост одређене таласне дужине да побуђује флуоресцентне супстанце.
① Методе побуђивања флуоресценције Према опсегу таласних дужина ексцитационог светла, постоје два типа: УВ метода ексцитације (метода ултраљубичастог осветљења) и БВ метода ексцитације (метода плаво-љубичастог осветљења). Метода УВ ексцитације користи ултраљубичасто светло краће од 400 нм за ексцитацију. Он генерише невидљиву флуоресценцију, тако да посматрана флуоресценција долази од самог узорка. Овај метод лако разликује специфичну флуоресценцију од аутофлуоресценције позадине.
② БВ метода ексцитације Метода БВ ексцитације користи ексцитационо светло у распону од љубичасте до плаве са центром на 404 нм и 434 нм. Пошто се плаво светло користи за озрачивање узорка, систем филтера за ексцитацију за ову методу мора у потпуности блокирати плаво светло и дозволити само потребно зелено и жуто светло да прође кроз њега. За бојење флуоресцентним антителом, максимална таласна дужина апсорпције ексцитационог светла је блиска максималној таласној дужини емисије флуоресцентне боје. Из тог разлога, сет филтера за БВ побуду мора да користи филтер са граничним филтером. Овај метод користи плаво светло за ексцитацију, тако да је ефикасност сакупљања флуоресценције релативно висока и могу се добити светлије слике. Његов недостатак је што се флуоресценција изнад 500 нм не може детектовати, а изнад 500 нм се могу видети само жуто-зелене слике. Код бојења флуоресцентним антителима, процена специфичности се у великој мери ослања на информације о боји, тако да недостатак методе ексцитације БВ може бити велико ограничење када се говори о суптилној специфичности.
