Директно бројање микроорганизама микроскопом
Експериментални принцип
Директно бројање под микроскопом помоћу хемоцитометра је уобичајена метода бројања микроба. Предност ове методе је у томе што је интуитиван и брз. Ставите одговарајуће разблажену бактеријску суспензију (или суспензију спора) у комору за бројање између стакалца и покривног стакла хемоцитометра и пребројите под микроскопом. Пошто је запремина коморе за бројање фиксна (0.1мм2), може се претворити у укупан број микроорганизама по јединици запремине према броју микроорганизама посматраних под микроскопом. Пошто ова метода броји збир живих и мртвих бактерија, назива се и методом укупног броја бактерија.
Хемоцитометар је обично посебна стаклена плочица на којој четири жлеба формирају три платформе. Платформа у средини је подељена на две половине кратким хоризонталним жлебом. На платформи је са сваке стране угравирана мрежа. Свака мрежа је подељена на девет великих квадрата. Велики квадрат у средини је соба за бројање. Микроорганизми се броје у комори за бројање. Структура плоче за бројање крвних зрнаца приказана је на слици Ⅷ-1.
Скала собе за бројање генерално има две спецификације, једна је да је велики квадрат подељен на 16 средњих квадрата, а сваки средњи квадрат је подељен на 25 малих квадрата (слика Ⅷ-2); други је велики трг. Квадрат је подељен на 25 средњих квадрата, а сваки средњи квадрат је подељен на 16 малих квадрата (слика Ⅷ-1, Ц). Али без обзира каква је табла за бројање, број малих квадрата у сваком великом квадрату је исти, односно 16×25=400 малих квадрата, као што је приказано на слици Ⅷ-2.
Дужина странице сваког великог квадрата је 1 мм, а површина сваког великог квадрата је 1 мм2. Након што је покровно стакло покривено, висина између клизног стакла и покривног стакла је 0.1 мм, тако да је запремина коморе за бројање 0.1мм3.
Када бројите, обично пребројите укупан број бактерија у пет средњих мрежа, затим добијете просечну вредност сваке средње мреже, а затим помножите са 16 или 25 да бисте добили укупан број бактерија у великој мрежи, а затим конвертујте у укупан број бактерија у 1мл бактеријског раствора.
Лабораторијска опрема
Хемоцитометар, микроскоп, покровно стакло, стерилна капилара;
Експериментални материјали
Суспензија Саццхаромицес церевисиае
Експериментални поступак (метода директног бројања микроскопом)
1. разблаживање
Правилно разблажите суспензију Саццхаромицес церевисиае. Ако бактеријски раствор није густ, не треба га разблажити.
2. Микроскопска соба за бројање
Пре додавања узорака, извршите микроскопски преглед коморе за бројање плоче за бројање. Ако има прљавштине, потребно је очистити пре бројања.
3. додати узорак
Чисту и суву плочу хемоцитометра прекријте покривним стаклом, а затим стерилном капаљком са финим уснама капните малу кап разблаженог раствора Саццхаромицес церевисиае са ивице поклопног стакла (не превише), тако да раствор бактерија је близу процепа дуж процепа. Капиларна осмоза сама улази у комору за бројање, а општа комора за бројање може се напунити бактеријском течношћу. Пазите да нема ваздушних мехурића.
4. број микроскопа
Након одмора од 5 минута, поставите хемоцитометар на степен микроскопа, прво користите сочиво мале снаге да бисте пронашли локацију коморе за бројање, а затим пређите на сочиво велике снаге за бројање. Ако се утврди да је бактеријски раствор сувише густ или прередак пре бројања, потребно је поново подесити разблаживање пре бројања. Генерално, за разблаживање узорка је потребно око 5-10 бактерија у свакој ћелији. Свака комора за бројање бира бактерије у 5 средњих мрежа (опционо 4 угла и централне мреже) за бројање. Бактерије на линији мреже се углавном броје само на горњој и десној линији. У случају пупања квасца, када величина тела пупољка достигне половину матичне ћелије, избројите две бактерије. Пребројите узорак да бисте израчунали садржај бактерија у узорку из вредности избројаних у две коморе за бројање.
5. Чишћење хемоцитометра
Након употребе, исперите плочу за бројање крвних зрнаца на славини млазом воде, не перите је тврдим предметима, а након прања је осушите сами или феном. Микроскопски преглед, посматрајте да ли у свакој ћелији има заосталих бактерија или других седимената. Ако није чист, мора се више пута прати док не буде чист.
