Технике проширења фокусне дубине за вишефотонску микроскопију
Комбинација двофотонског ласерског скенирајућег микроскопа и индикатора калцијума је златни стандард за детекцију неуронских сигнала ин виво. Неурони у неуронским мрежама су распоређени у тродимензионалном простору, а праћење динамике њихове активности захтева начин да се брзо побољша брзина снимања запремине. Међутим, коришћењем решеткастог скенирајућег мултифотонског микроскопа за снимање великог броја слика, ако се користи објектив са високим нумеричким отвором (НА) за постизање веће латералне резолуције, то ће резултирати мањом жижном дубином. Да бисте добили обимну слику на малој фокусној дубини,
Неопходно је извршити скенирање З-осе на неки начин, сликајући многе равни скенирањем сваке фокалне равни, што у великој мери ограничава брзину снимања. Ако се информације о аксијалној слици могу жртвовати и скенирање запремине може да се постигне у једном бочном скенирању проширењем дубине фокуса, то јест, информације о запремини се пројектују на једну 2Д слику, брзина снимања се може знатно побољшати. Ово се назива снимање проширене дубине фокуса (ЕДФ), што је посебно корисно за снимање ретке структуре становништва које захтевају високу временску резолуцију, као што је функционално снимање неуронске активности.
Аксијална и бочна резолуција микроскопа одређују се нумеричким отвором (НА) сочива објектива. Висок НА може максимизирати аксијалну и бочну резолуцију, као и количину прикупљене светлости; Нижи НА ће резултирати нижом аксијалном резолуцијом, односно већом дубином фокуса, али ће истовремено жртвовати бочну резолуцију и ефикасност сакупљања светлости. Метода проширења дубине фокуса која ће бити уведена у наставку може постићи ово уз одржавање високе бочне резолуције и довољног светлосног флукса.
Коришћењем просторних модулатора светлости за генерисање фокалних витких Беселових зрака може се постићи ЕДФ сликање, али модулатори просторног светла су гломазни и тешко их је компатибилни са уским просторима микроскопа; Насупрот томе, Беселови модули засновани на аксијалним пирамидама су јефтини и компактни, али могу да генеришу само жаришне тачке фиксне дубине и нису погодни за различите експерименте који захтевају континуиране промене фокусне дубине. Да би се позабавили овим проблемом, 2018. РОНГВЕН ЛУ ет ал. демонстрирао Беселов модул заснован на аксикону, у коме само једно сочиво треба да се преведе дуж оптичке осе да би се континуирано подешавала аксијална дужина Беселове фокусне тачке.
