Методе за проширење фокусне дубине вишефотонских микроскопа
Комбинација дво-фотонског ласерског скенирајућег микроскопа и индикатора калцијума је златни стандард за детекцију неуронских сигнала ин виво. Неурони у неуронским мрежама су распоређени у тродимензионалном простору-и праћење динамике њихове активности захтева начин да се брзо побољша брзина снимања запремине. Међутим, коришћењем решеткастог скенирајућег мултифотонског микроскопа за снимање великог броја слика, ако се користи објектив са високим нумеричким отвором (НА) за постизање веће бочне резолуције, то ће резултирати мањом жижном дубином. Да бисте добили обимну слику на малој фокусној дубини,
Неопходно је извршити скенирање З-осе на неки начин, сликајући више равни скенирањем сваке фокалне равни, што у великој мери ограничава брзину снимања. Ако се информације о аксијалној слици могу жртвовати и скенирање запремине може да се постигне у једном бочном скенирању проширењем дубине фокуса, односно, информације о запремини се пројектују на једну 2Д слику, брзина снимања се може знатно побољшати. Ово се назива снимање проширене дубине фокуса (ЕДФ), што је посебно корисно за снимање ретке структуре становништва које захтевају високу временску резолуцију, као што је функционално снимање неуронске активности.
Аксијална и бочна резолуција микроскопа одређују се нумеричким отвором (НА) сочива објектива. Висок НА може максимизирати аксијалну и бочну резолуцију, као и количину прикупљене светлости; Нижи НА ће резултирати нижом аксијалном резолуцијом, односно већом дубином фокуса, али ће истовремено жртвовати бочну резолуцију и ефикасност сакупљања светлости. Метода проширења дубине фокуса која ће бити уведена у наставку може постићи ово уз одржавање високе бочне резолуције и довољног светлосног флукса.
Коришћењем просторних модулатора светлости за генерисање фокалних витких Беселових зрака може се постићи ЕДФ сликање, али модулатори просторног светла су гломазни и тешко их је компатибилни са уским просторима микроскопа; Насупрот томе, Беселови модули засновани на аксијалним пирамидама су јефтини и компактни, али могу да генеришу само жаришне тачке фиксне дубине и нису погодни за различите експерименте који захтевају континуиране промене у жижној дубини. Да би се позабавили овим проблемом, 2018. РОНГВЕН ЛУ ет ал. демонстрирао Беселов модул заснован на аксикону, у којем само једно сочиво треба да се преведе дуж оптичке осе да би се континуирано подешавала аксијална дужина Беселове фокусне тачке.
Слика 1 (а) Дијаграм уређаја Беселовог модула; (б) Функција ширења тачке је експериментално измерена када је Д био -12 мм, 0 мм и 12 мм, респективно; (ц) Однос између бочне пуне ширине на пола максимума, (д) аксијалне пуне ширине на пола максимума, (е) вршног сигнала и (ф) оптичке снаге иза сочива објектива са Л2 помаком Д
Модул уређај за формирање Беселове жаришне тачке променљиве дужине приказан је на слици 1а. Упадни Гаусов сноп се обликује у кружни сноп након проласка кроз аксикон и сочиво Л1. Следећа маска кружног отвора може да блокира залуталу светлост узроковану дефектима аксикона, чиме се обликује аксијална дистрибуција функције ширења тачке побуђивања два-фотона. Затим се светлосни сноп пројектује на галванометар помоћу сочива Л2 и Л3, а затим преко сочива Л4 и Л5 стиже у задњу жижну раван сочива објектива.
Ови дизајни су слични традиционалним пирамидалним базираним модулима, с том разликом што се померањем Л2 или Л3 дуж оптичке осе, аксијална дужина Беселовог фокуса може континуирано подешавати. Слика 1б приказује функције ширења аксијалних тачака за Д вредности од -12 мм, 0 мм и 12 мм, са аксијалном пуном ширином на половини максимума од 39? м,24? М и 14? м. Као што је приказано на слици 1ц-ф, померање сочива Л2 с лева на десно може континуирано променити пуну ширину на пола максимума иу попречном и у аксијалном правцу, што значи да се дубина фокуса може континуирано мењати. Резултати нумеричке симулације засновани на теорији векторске дифракције су у доброј сагласности са експерименталним подацима. Слика 2 верификује ефекат корекције различитих величина прстенастих маски на дефекте аксикона. Утврђено је да тање прстенасте маске могу боље оптимизовати дистрибуцију аксијалног интензитета излазног Беселовог снопа, али истовремено доводе и до већег губитка снаге.
