Оптичке особине биолошких микроскопа
Оптичке перформансе микроскопа одређују следећих осам основних оптичких параметара (или параметара):
(1) Нумерички отвор бленде
Нумерички отвор бленде се назива и однос огледала. Односи се на производ индекса преламања н средине између посматраног објекта и сочива и синусне вредности половине угла сочива објектива. Користите НА или А. за представљање. НА{0}}нсин( /2)
Такозвани усни угао огледала се односи на угао између маргиналних зрака посматране тачке који улазе у предње сочиво сочива објектива.
Нумерички отвор бленде је важан параметар сочива објектива и кондензаторског сочива и уско је повезан са другим оптичким параметрима микроскопа. Углавном се нада да што је веће, то боље. Из формуле се види да постоје два начина за повећање нумеричке бленде, један је повећање угла ушћа огледала, а други повећање индекса преламања између сочива објектива и узорка.
Када се усвоји претходни метод, узорак и предмет се могу држати што ближе. Али без обзира колико близу, увек је мањи од 180 степени. Дакле, син( /2) је такође мањи од 1. Индекс преламања ваздуха је н=1. Због тога је нумерички отвор нсин( /2) сочива сувог објектива увек мањи од 1, углавном између 0.04 и 0.95.
Када се усвоји ова друга метода, између сочива објектива и узорка може се додати медијум са већим индексом преламања. На пример, индекс преламања кедровог уља је н=1.515. Када се као медијум користи кедрово уље, нумерички отвор може да достигне више од 1,2. Због тога се у неким случајевима користе уљне наочаре. Тренутно, максимални нумерички отвор који уљно сочиво може да постигне је 1,4.
(2) Резолуција
Резолуција се такође назива стопа дискриминације или моћ решавања. Такозвана резолуција се односи на способност микроскопа да разликује фину структуру предмета који се прегледа. Она је обрнуто пропорционална удаљености резолуције. Раздаљина резолуције се односи на минимално растојање између две тачке објекта које се могу разликовати. Што је раздаљина резолуције мања, то је већа резолуција микроскопа. Ако је растојање између две тачке објекта мање од раздаљине резолуције, две тачке ће бити погрешне за једну тачку, а њена структура се не може јасно видети. Резолуција микроскопа је одређена сочивом објектива. Окулари само увећавају и не повећавају резолуцију микроскопа.
У случају нормалног централног осветљења, разлучивост д сочива објектива одређена је следећом формулом.
d=(λ/2)N.A.
У формули: д представља раздаљину резолуције, јединица је микрон, λ представља таласну дужину светлости осветљења, јединица је такође микрон.
У видљивој светлости, таласна дужина са највећим сјајем и најосјетљивијом на људске очи је {{0}}.55 μм, а максимална НА сочива објектива је 1,4. Заменивши горњу формулу, д је приближно 0.2 μм. Односно, код обичног оптичког микроскопа граница раздаљине резолуције је 0.2 μм у случају централног осветљења. То јест, обични оптички микроскопи не могу разликовати два објекта мања од 0,2 μм.
Коришћењем ултраљубичастог светла, таласна дужина светлости осветљења може да се смањи, омогућавајући да раздаљина резолуције достигне 0.1 μм. Али ултраљубичасте зраке људско око не може видети. Може се посматрати тек након снимања слике.
Таласна дужина протока електрона је само 0.00387нм. Коришћењем "електронског сочива" или магнетног сочива за контролу протока електрона, раздаљина резолуције електронског микроскопа је до неколико десетина нанометра. Може се користити за посматрање структуре атома.
(3) Увећање
Увећање микроскопа је једнако производу увећања сочива објектива и увећања окулара. У принципу, увећање се може учинити веома великим. Међутим, ако се детаљи узорка не могу разлучити сочивом објектива, без обзира колико је велико увећање, то је бесмислено. Теоретски, може се закључити да је најпогодније увећање микроскопа (које се назива ефективно увећање, ефективно представљено са М) између 500 и 1000 пута веће од нумеричког отвора сочива објектива. То јест, 500Н.А. Мање или једнако М ефективно Мање или једнако 1000Н.А.
У оквиру ефективног опсега увећања, очи могу посматрати дуго времена без умора. Ако је увећање мање од 500 НА, биће тешко посматрати. Ако је већи од 1000Н.А., то ће погоршати квалитет слике и чак узроковати нестварну слику. Дакле, увећање преко 1000Н.А. назива се неважећим увећањем.
(4) Радна удаљеност
Радна удаљеност се односи на растојање између доње површине сочива објектива и горње површине покривног стакла након што се микроскоп фокусира, коришћењем стандардног покровног стакла и стандардне механичке дужине цеви. Што је веће увећање сочива објектива, краћа је радна удаљеност. Генерално, радна удаљеност сочива објектива мале снаге испод 10 пута је 5-7мм, док је радна удаљеност сочива 100 пута уља само око 0,19 мм.
(5) Дубина фокуса
Када је микроскоп фокусиран на одређену раван у узорку, не само да се раван објекта може јасно видети, већ се истовремено могу јасно видети и горња и доња раван предмета који су са њом повезани. Удаљеност између горње и доње равни објекта назива се дубина фокуса или скраћено дубина фокуса.
Дубина фокуса микроскопа је веома мала, а што је већи нумерички отвор, то је веће укупно увећање, а дубина фокуса је мања. На пример, када користите уљно сочиво са НА од 1,25/100 пута и окулар 12,5 пута за посматрање, дубина фокуса је само 0,27 μм. Односно, након фокусирања, може се јасно видети само танак слој дебљине 0,27 μм. Обични узорци су углавном дебљине неколико микрона. Да бисте видели цео узорак, потребно је користити механизам за фино подешавање микроскопа за посматрање у слојевима од врха до дна.
(6) видно поље
Видно поље се још назива и видно поље. Односи се на обим предмета који се прегледа и који микроскоп може истовремено да види. Обично желимо да видно поље буде што веће. Видно поље микроскопа је одређено видним пољем сочива објектива и видним пољем окулара. Видно поље обичног објектива је мање од 20 мм, а велико може досећи више од 40 мм. Видно поље обичних окулара 10к је 14 мм, а велики могу достићи и више од 24 мм. Када су објектив и окулар дизајнирани, њихово видно поље је фиксирано. Пошто је видно поље општег микроскопа мало, немогуће је видети цео узорак у једном видном пољу, може се видети само веома мали круг на узорку. Штавише, величина видног поља је обрнуто пропорционална укупном увећању микроскопа. Што је веће укупно увећање, то је мање видно поље. Решење је да се помоћу покретача учини да сваки део узорка редом уђе у видно поље и посматра наизменично.
(7) Осветљеност огледала
Осветљеност огледала се односи на светлост и таму слике објекта која се види у микроскопу. Да бисмо олакшали посматрање, надамо се да је резултујућа слика светлија. У случају константног спољашњег светла, осветљеност огледала је пропорционална квадрату нумеричког отвора и обрнуто пропорционална квадрату укупног увећања. Да би слика била светлија, потребно је користити сочиво објектива са великим нумеричким отвором са окуларом са малим увећањем. На пример, у случају истог објектива, коришћење окулара 5Кс ће произвести слику у огледалу која је 4 пута светлија од коришћења окулара од 10Кс.
За микроскопе који користе електричне изворе светлости, осветљеност слике у огледалу може се контролисати подешавањем осветљености осветљивача.
(8) Јасноћа
Јасноћа микроскопа зависи од његовог оптичког система, посебно од оптичких перформанси сочива објектива. Односи се на пројектовање, производњу, употребу и складиштење микроскопа. То је важно и сложено питање. Из перспективе употребе и складиштења, главни разлози који утичу на јасноћу су: дебљина коришћеног покривног стакла је неквалификована, фокус није подешен на идеалну позицију, укупно увећање је превелико и сочиво уља сочиво није обрисано. Чист, плесни на сочиву итд.
