Принцип и конструкција флуоресцентног микроскопа
Флуоресцентни микроскоп користи тачкасти извор светлости високе ефикасности, који емитује одређену таласну дужину светлости (као што је ултраљубичасто светло 3650 ин или љубичасто плаво светло 4200 ин) кроз систем за филтрирање боја као ексцитационо светло и побуђује флуоресцентне супстанце у узорку да емитују различите боје флуоресценције. Након тога се посматра кроз увећање објектива и окулара. На овај начин, чак и са слабом флуоресценцијом, лако је препознатљив и веома осетљив под јаким контрастним позадинама, углавном се користи за проучавање структуре и функције ћелије, као и хемијског састава. Основна структура флуоресцентног микроскопа састоји се од обичног оптичког микроскопа и неких додатака (као што су флуоресцентни извор светлости, ексцитациони филтер, бихроматски сепаратор зрака и филтер за блокирање, итд.). Флуоресцентни извори светлости – обично користе живине лампе ултра високог притиска (50-200В), које могу да емитују светлост различитих таласних дужина. Међутим, свака флуоресцентна супстанца има таласну дужину побуђивачке светлости која производи најјачу флуоресценцију, тако да је потребно додати филтере ексцитације (обично ултраљубичасти, љубичасти, плави и зелени ексцитациони филтери) како би се омогућило само одређеној таласној дужини ексцитационог светла да прође и осветли узорак, док апсорбује сву другу светлост. Након што је озрачена побуђеном светлошћу, свака супстанца емитује видљиву флуоресценцију са већом таласном дужином од зрачења у веома кратком временском периоду. Флуоресценција има специфичност и генерално је слабија од ексцитационе светлости. Да би се посматрала специфична флуоресценција, иза сочива објектива треба додати филтер за блокирање (или потискивање). Има две функције: прво, апсорбује и блокира ексцитационо светло да уђе у окулар како би се избегло ометање флуоресценције и оштећење очију; друго, бира и дозвољава да прође специфична флуоресценција, приказујући специфичну боју флуоресценције. Оба типа филтера морају бити изабрана за употребу заједно.
Постоје две врсте флуоресцентних микроскопа на основу њиховог оптичког пута:
1. Трансмисиони флуоресцентни микроскоп: Ексцитациони извор светлости се преноси кроз материјал узорка кроз кондензатор да би побудио флуоресценцију. Уобичајени колектори светлости тамног поља, или обични колектори светлости, могу се користити за подешавање рефлектора за претварање побудне светлости и бочне светлости на узорак. Ово је релативно старомодан флуоресцентни микроскоп. Његова предност је што је флуоресценција јака при малом увећању, док је недостатак што флуоресценција слаби са повећањем увећања. Због тога је боље посматрати веће материјале узорака.
2. Флуоресценцијски микроскоп са падајућим снопом Ово је нова врста флуоресцентног микроскопа развијена у модерним временима. За разлику од претходног, побудна светлост пада са сочива објектива на површину узорка, користећи исто сочиво објектива као кондензатор осветљења и сочиво објектива за прикупљање флуоресценције. Двобојни сепаратор снопа треба додати на оптичку путању, која је под углом од 45 степени у односу на лагани уранијум. Побуђена светлост се рефлектује у сочиво објектива и концентрише на узорак. Флуоресценција коју генерише узорак, као и побудна светлост која се рефлектује од површине сочива објектива и покривног стакла, истовремено улазе у сочиво објектива и враћају се у сепаратор дихроичног снопа, раздвајајући ексцитацију и флуоресценцију. Преостало узбуђење тада апсорбује филтер за блокирање. Ако се користе различити филтери за побуђивање/двобојни сепаратори зрака/комбинације филтера за блокирање, они могу задовољити потребе различитих флуоресцентних реакционих производа. Предност овог флуоресцентног микроскопа је у томе што је видно поље уједначено, слика је јасна, а што је веће увећање, то је флуоресценција јача.
