Стандардна процедура за калибрацију поларизатора у поларизационом микроскопу
Флуоресцентни микроскоп се разликује од обичног оптичког микроскопа по томе што не посматра узорке под осветљењем обичних извора светлости. Уместо тога, он користи одређену таласну дужину светлости (обично ултраљубичасто светло, плавољубичасто светло) да побуђује флуоресцентне супстанце унутар узорка под микроскопом, узрокујући да емитују флуоресценцију. Дакле, улога извора светлости у флуоресцентном микроскопу није директно осветљење, већ као извор енергије за побуђивање флуоресцентних супстанци унутар узорка. Разлог зашто можемо да посматрамо узорке није у осветљењу извора светлости, већ у феномену флуоресценције који показују флуоресцентне супстанце унутар узорка након апсорбовања побуђене светлосне енергије. Из овога се може видети да је карактеристика флуоресцентне микроскопије углавном то што њен извор светлости може да обезбеди велику количину ексцитационе светлости у одређеном опсегу таласних дужина, тако да флуоресцентне супстанце у узорку могу да добију неопходан интензитет ексцитационе светлости. Истовремено, флуоресцентни микроскопи морају имати одговарајуће системе филтера. Флуоресцентни микроскоп је основни алат у хемији флуоресцентног ткива. Састоји се од главних компоненти као што су ултра-извор светлости високог напона, систем филтера (укључујући филтерске плоче за побуђивање и потискивање), оптички систем и систем за фотографисање. Користи светлост одређене таласне дужине да побуђује узорак и емитује флуоресценцију.
1. Методе ексцитације флуоресценције: Према опсегу таласних дужина светлости, постоје два типа: УВ ексцитациони метод (користећи ултраљубичасто осветљење) и БВ метод ексцитације (користећи плаво љубичасто светло). Метода УВ ексцитације користи скоро ултраљубичасто светло краће од 400нм за ексцитацију. Ова метода нема видљиву ексцитацију светлости, тако да посматрана флуоресценција показује инхерентну флуоресценцију боје, што олакшава разликовање специфичне флуоресценције на узорку од самофлуоресценције позадинског ткива.
2. Метода БВ ексцитације: Укључује ексцитацију од ултраљубичастог до плавог светла са центром на 404нм и 434нм. Ова метода користи плаво светло за озрачивање узорка, тако да искључени-филтер система за посматрање флуоресценције мора да користи филтер који може у потпуности да блокира плаво светло и у потпуности прође кроз потребну зелену и жуту флуоресценцију. Флуоресцентни пигменти који се користе за методу флуоресцентних антитела. Максимална таласна дужина апсорпције ексцитационе светлости и максимална таласна дужина емисије флуоресценције су релативно близу, тако да филтер који се користи у БВ методи ексцитације мора да користи филтер оштрог пресека. Овај метод може користити плаво светло као побудно светло, тако да је ефикасност апсорпције флуоресцентних пигмената висока, а могу се добити светлије слике. Недостатак је што се флуоресценција испод 500нм не може видети, док флуоресценција изнад 500нм чини да цела слика изгледа жуто. У методи флуоресцентних антитела, специфичност је углавном одређена бојом јединственом за флуоресцентне пигменте, тако да када се говори о суптилној специфичности, недостаци методе ексцитације БВ која је горе поменута често имају значајан утицај.
