Техничке карактеристике и вештине употребе двофотонског флуоресцентног микроскопа
Двофотонска флуоресцентна микроскопија је нова технологија која комбинује конфокалну микроскопију ласерског скенирања и технологију двофотонске ексцитације.
Основни принцип двофотонске ексцитације је: у случају велике густине фотона, флуоресцентни молекули могу истовремено да апсорбују два фотона дугих таласа и да емитују фотон краће таласне дужине након кратког периода живота у такозваном побуђеном стању. . ; Ефекат је исти као коришћење фотона са таласном дужином упола мањом од дуге таласне дужине да се побуђује флуоресцентни молекул. Двофотонско побуђивање захтева велику густину фотона. Да не би оштетили ћелије, двофотонска микроскопија користи импулсне ласере са закључавањем мода високе енергије. Ласер који емитује овај ласер има високу вршну енергију и ниску просечну енергију, ширина пулса му је само 100 фемтосекунди, а период може да достигне 80 до 100 мегахерца. Када користите објектив објектива са високим нумеричким отвором за фокусирање фотона импулсног ласера, густина фотона у фокусној тачки сочива објектива је највећа, а двофотонско побуђивање се јавља само у фокусној тачки сочива објектива, тако да двофотонском микроскопу није потребан конфокални отвор, што побољшава ефикасност детекције флуоресценције. То је важан истраживачки метод у областима морфологије, молекуларне биологије ћелије, неуронауке и фармакологије.
1. Позадина појаве двофотонске микроскопије - два ограничења традиционалне ласерске конфокалне микроскопије:
1) Један је феномен фототоксичности: зато што конфокална рупица мора бити довољно мала да би се добила слика високе резолуције, а мали отвор ће блокирати велики део флуоресценције која се емитује из узорка, укључујући флуоресценцију која се емитује из фокалне равни, одговарајуће Да, побудна светлост мора бити довољно јака да добије довољан однос сигнал-шум; а ласер високог интензитета ће проузроковати да флуоресцентна боја брзо избледи током непрекидног скенирања, а флуоресцентни сигнал ће постајати све слабији како скенирање напредује.
2) Фототоксичност је још један проблем. Под ласерским зрачењем, многи молекули флуоресцентне боје производиће цитотоксине као што су синглетни кисеоник или слободни радикали, тако да време скенирања и густина оптичке снаге ексцитационог светла треба да буду ограничени у експерименту да би се одржала густина узорка. активан. У истраживању активних узорака, посебно различитих фаза раста и развоја активних узорака, фотобељење и фототоксичност чине ове студије веома ограниченим.
2. Зашто кажете да двофотонски микроскопи генерално не морају бити опремљени ултраљубичастим ексцитационим ласерима?
Двофотонска микроскопија је технологија побуђивања флуоресценције заснована на ефекту двофотонске ексцитације: молекули флуоресцентне боје могу бити узбуђени апсорбовањем два фотона ниске енергије у исто време (временски интервал између два фотона који достижу флуоресцентне молекуле је мањи од 1 фемтосекунде ), његов ефекат ексцитације може бити еквивалентан апсорбовању фотона високе енергије од 1/2 таласне дужине. На пример, апсорбовање два фотона на црвеним таласним дужинама је еквивалентно молекулу који апсорбује ултраљубичасто. Фотоне дугих таласа ћелије не апсорбују лако, па је фототоксичност за живе ћелије смањена, а такође је смањено и фотобељење. На овај начин не само да игра функцију ултраљубичасте ексцитације, већ и избегава оштећење узорка ултраљубичастом светлошћу.
3. Шта је посебно код ласера двофотонског микроскопа?
Вероватноћа двофотонске апсорпције зависи од тога колико се блиско два упадна фотона поклапају у простору и времену (два фотона морају стићи у року од 10-18 секунди). Попречни пресек двофотонске апсорпције је мали и побуђују се само флуорофори у областима са великим фотонским флуксом. Стога, већина ласера који се користе су титан сафир ласери, који могу постићи пикосекундне или фемтосекундне брзине скенирања, и имају веома високу вршну снагу и ниску просечну снагу, тако да се фотобељење и фототоксичност могу смањити или елиминисати. Најважније је обезбедити веома високу густину фотона у малом опсегу, што може да обезбеди истовремену побуду два фотона.
4. Које су предности двофотонске побуде?
1) Повећајте селективност боје: опсег побудне светлости ласера конфокалног система (Ар, Ар/Кр, ХеНе) је 488нм - 647нм. То значи експериментисање са флуоресцентним бојама побуђеним УВ зрачењем, нпр. са ДАПИ, Хоесцхт. Таласна дужина ексцитације двофотона је двоструко већа од једнофотонске, тако да боје побуђене ултраљубичастим светлом могу бити побуђене блиском инфрацрвеном светлошћу.
2) Смањите фотобељење: Због смањења фотоизбељивања, повећава се стопа успеха експеримената који користе ЦФП/ИФП за пренос енергије флуоресцентне резонанце (ФРЕТ).
3) Није потребно посебно сочиво објектива: Са хардверске тачке гледишта, ексцитација УВ побуђених боја таласном дужином блиске инфрацрвене светлости не захтева посебне УВ оптичке компоненте.
4) Побољшајте однос сигнал-шум: таласна дужина побуђене светлости и таласна дужина емитоване светлости имају велику разлику, што побољшава однос сигнал-шум.
5) Избељивање локализовано на жижној тачки: Пошто се ексцитација флуоресценције јавља само у фокусној тачки објектива, нема потребе за конфокалним отвором. Ово побољшава детекцију светлости и фотоизбељивање се дешава само у жаришној тачки.
6) Лакше продрети у узорке: Инфрацрвено светло таласне дужине се не распршује лако од стране ћелија и може продрети у дубље узорке.
5. У поређењу са ласерском скенирајућом конфокалном микроскопијом, које је највеће побољшање направљено двофотонском микроскопијом?
1) Смањено фотобељење.
2) Смањена фототоксичност.
3) Није лако распршити, а лакше је продрети у дебеле узорке, као што су мождане кришке.
