Постоје две врсте флуоресцентних микроскопа у смислу њихове оптичке путање
1. Трансмисиони флуоресцентни микроскоп: Ексцитациони извор светлости се пропушта кроз материјал узорка кроз кондензаторско сочиво да би побудио флуоресценцију. Обично се користи колектор тамног поља, а обичан колектор се такође може користити за подешавање огледала тако да се побудна светлост преусмери и заобиђе на узорак. Ово је старији флуоресцентни микроскоп. Предност је што је флуоресценција јака при малом увећању, али недостатак је што се флуоресценција смањује са повећањем увећања. Због тога је боље посматрати веће материјале узорака.
2. Епи-флуоресцентни микроскоп је нова врста флуоресцентног микроскопа развијена у модерно доба. Разлика је у томе што побудна светлост пада са сочива објектива на површину узорка, односно, исто сочиво објектива се користи као кондензатор осветљења и сочиво објектива за прикупљање флуоресценције. Дихроични разделник снопа треба додати у путању светлости, која је удаљена 45 степени од лаког уранијума. Побуђена светлост се рефлектује у сочиво објектива и сакупља на узорку. Флуоресценција коју генерише узорак и побудна светлост рефлектована од површине сочива сочива објектива и површине поклопца стакла улазе у сочиво објектива у исто време и враћају се у двобојни разделник снопа да би побудна светлост била одвојена од флуоресценције , преостала побудна светлост се апсорбује блокирајућим филтерима. Као што је промена на комбинацију различитих ексцитационих филтера / двобојног разделника зрака / филтера за блокирање, може задовољити потребе различитих производа флуоресцентне реакције. Предност ове врсте флуоресцентног микроскопа је у томе што је осветљење видног поља уједначено, слика јасна, а што је веће увећање, то је флуоресценција јача.
